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牻牛儿醇-10-脱氢酶活性的测定 牻牛儿醇-10-脱氢酶是次番木鳖甙生物合成途径的关键酶,它催化牻牛儿醇脱氢后生成10 一脱氢 牻牛儿醇。该提取后可以用GC 或同位素法测定单位时间内10-牻牛儿醇的生成量来测定牻牛儿 醇-10-脱氢酶的活性。 1.仪器设备 气相色谱仪(GC)(火焰离子检测器)、液体闪烁计数器、层析缸、高速离心机、超速离心机、恒温 水浴等。 2.操作方法 1）GC(火焰离子检测器)法 （1）提取:称2g 植物材料(鲜重),0.5g 石英砂和12ml0.1mmol/LTis-HCl 绥冲液(含0.4mol/L 蔗 糖,10mmol/LKCl,10mmol/LMgCl ,10mmol/LEDTA,10mmol/LK S 0 ,1mmol/LDTT,pH7.6)一起加 2 2 2 4 人研体。在冰上研磨后加入少量以缓冲液饱和的强碱性阴离子交换树脂Dowex 充分搅拌。 20000×g 离心20min,上清液在 110000g 离心1h,小心收集沉淀(微体部分),悬浮于磷酸级冲液中。 2）酶活性测定:在试管内加入150ul 沉淀悬浮液,450ul50mmol/LK HPO /KH PO 缓冲液(含