尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶（NADase）法定量钙调素.pdfVIP

尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸激酶 （NADase）法定量钙调素 NAD 激酶是目前已知的唯一能催化NAD 磷酸化生成NADP 的酶，是高等植物中重要的调 节蛋白之一。钙调素为其生理激活剂。根据这两种蛋白质在DEAE 纤维素阴离子交换柱中被吸 附能力不同，将其分离，然后收集。提取不含CaM 的NADase 供试。CaM 依赖性NAD 激酶的 活性依赖于活性CaM，两者之间成定量关系，因此可用该酶定量CaM。其灵敏度高，专一性强， 不受磷脂和脂肪酸的影响。 1.仪器设备 高速冷冻离心机、组织捣碎机、酸度计、恒温水浴、紫外分光光度计、台式离心机、定量加 样器等。 2.操作方法 1）NAD 激酶的分离、提取：取豌豆种子在自然光下25～30℃水培11～12d。提取过程在0～ 4℃下进行。取新鲜豌豆幼苗叶片75g，置冰箱中冷冻0.5h 后，加入3倍体积缓冲液Ⅰ （含25mmol /LTris-HCl ，0.5%PVP，w/v，pH8.0），并加入适量蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF8.7mg/L）， 用高速组织捣碎机充分捣碎（20000r/min，40s/次，3～5 次），匀浆用4 层纱布过滤后，以12000×g 离心30min，取上清液缓慢加固体硫铵，轻搅至50%饱和度 （31.3g/100ml）后，于4C冰箱中静