丁酸梭菌的筛选及对斑马鱼幼鱼益生效果的评估.pdfVIP

摘要 摘要 随着水产行业迅速发展，工厂化大规模养殖成为趋势，疾病爆发、传统水产 饲料资源日渐匮乏等成为发展限制因素。在畜牧业和水产养殖中，通过添加益生 菌可以预防和治疗疾病，增加对饲料的消化性，提升生长性能，调节肠道菌群， 刺激免疫，从而提升动物的健康性能和经济价值。丁酸梭菌作为厌氧益生菌，在 人和畜牧中有多年的应用和研究，但在水产养殖中相对较少。本研究从土壤和鸡 粪便中筛选具有产消化酶、黏附性、抑制致病菌等特性的丁酸梭菌，评价其体外 生物学活性和安全性，结合模式动物斑马鱼，通过幼鱼体内实验，探究丁酸梭菌 对斑马鱼幼鱼生长性能、抑制嗜水气单胞菌、抗氧化、产淀粉酶和免疫刺激方面 的作用。 (1)丁酸梭菌的筛选：采用厌氧培养法，通过选择性培养基富集和丁酸梭菌特 异性引物PCR 方法高效筛选，16S rDNA 基因鉴定得到15 株丁酸梭菌菌株。根 据样品来源选取5 株进行疏水性、自凝集、抑制嗜水气单胞菌、产淀粉酶和菌生 长量的测定。结果显示：与其它菌株相对比，丁酸梭菌11 号疏水性为24.12% ， 自凝集性(5h)为68.30% ，有较好黏附性，抑菌圈达到14.3mm，形成的淀粉酶透 7 明圈/菌落直径为2.45 ，RCM 液体培养24h 菌量达到2.22 ×10 cfu/ml,综合性能较 好。 (2)丁酸梭菌生物学特性：评估丁酸梭菌11 号对胃肠液环境，高温和氧气的 耐受性，是否含有相关致病基因。通过实验结果显示，在含有0.3%猪胆盐的RCM 液体培养基中依旧可以较好的生长，相对于对照，存活率为 62.47% ，丁酸梭菌 11 号在分别经过160min 的人工模拟胃液和肠液处理后，与对照相比，存活率均 在80% 以上，表明丁酸梭菌11 号能够很好的耐受胃肠道环境。在经过温度70℃， 20min 时长的水浴加热处理后，与对照相比，有 61.23%的存活率。对高温具有 较好的耐受性。经过10 和30min 的有氧暴露后，存活率都在55% 以上，表明11 号菌对短期暴露氧气环境的非致死性，在遇到生长条件合适时可以重新萌发。通 过PCR 方法检测发现丁酸梭菌 11 号不含致病基因- 肉毒梭菌E 。丁酸梭菌11 号 具有良好的生物学耐受性，适应加工储藏和胃肠道环境，不含梭菌属常见致病基 因- 肉毒梭菌E ，具有良好的益生潜能。 (3)在丁酸梭菌 11 号体外研究的基础上，结合斑马鱼模式动物，探究其对斑 马鱼生长性能、抗病、抗氧化、产淀粉酶和对免疫细胞因子调控的影响。在斑马 鱼出生后 5-15d 期间，通过养殖水添加丁酸梭菌，在 15-40d 期间，通过喂食含 5 菌饲料添加丁酸梭菌。结果显示CB2 组(水中添加浓度10 cfu/ml ，饲料中添加浓 7 度 10 cfu/g)在喂养40d 后，相对于对照组，斑马鱼体重增加(P0.0 1) ，对40d 的 I 摘要 斑马鱼幼鱼进行嗜水气单胞菌攻毒实验，实验组与对照组死亡率没有显著性差 异，CB2 组有一定延缓斑马鱼幼鱼死亡时间的效果。加菌的三个实验组T-AOC 、 α-淀粉酶水平均显著升高，MDA 水平显著下降，与对照组相比都具有显著性差 异(P0.05) 。CB2 组提高细胞因子TLR2、IL-8 和TNF-α 的mRNA 相对表达水平， 对MyD88 、IGF-1a 和IL-10 mRNA 的相对表达水平没有影响，推测丁酸梭菌可 能以MyD88 非依赖性的方式，通过 TLR2 信号传导刺激免疫细胞分泌 IL-8 和 TNF-α 。 综上所述，本研究筛选到的丁酸梭菌 11 号，在产淀粉酶、耐胃肠液、耐高 温等方面具有良好的性质，在斑马鱼幼鱼体内实验中，丁酸梭菌可以在水中和饲 料中存活，不影响斑马鱼幼鱼存活率，可以提高幼鱼生长性能，对嗜水气单胞菌 攻毒有延缓死亡的趋势，可以提高鱼体抗氧化、产淀粉酶水平、降低MDA 含量、 提高TLR2、IL-8 和TNF-α mRNA 相对表达水平，刺激免疫系统，作为益生菌在 水产