蛋白去磷酸化.docxVIP

磷酸化的检测 液氮研磨，200mg样品加入150ul蛋白磷酸酶2x buffer( 2x λ-PPase buffer from NEB,2 mM MnCl2, 2% Triton X-100, 2x complete protease inhibitor cocktail (Roche))； 涡旋震荡3次（每隔5min一次），12000rpm离心5min（两次）； 吸取上清，分成50ul一管，加入1ulλ-PPase（NEB）,负对照加入10mM Na2VO3或1ul 煮沸过的λ-PPase（NEB）。 30度反应 30-60 min, 加入SDS-loading Buffer，沸水煮5min； 8%SDS， 80V恒压，低温电泳2hr（根据蛋白调整，越大的蛋白电泳时间越长）； 转膜与免疫印迹与普通的蛋白相同。 注：提取液的加入量与lysis buffer相同，蛋白酶抑制剂只加PIC，不要超量以免过度抑制蛋白磷酸酶活性。 实验结果： Cry2-GFP(-) Cry2-GFP(+) pyB-GFP(Rc) Cry2-GFP(+) Cry2-GFP(-) 箭头所指为磷酸化蛋白条带，+指加入λ-PPase，-指负对照。