2023年届高三生物基因工程(必备知识)基因工程二轮复习.docx

2023 届高三生物 基因工程〔必备学问〕 1.熟记基因工程的四个操作步骤: 目的基因的猎取: 方法 化学方法逆转 录法 人 工合 PCR 成 技术 扩增 具体操作 核苷酸序列的较小基因,直接利用 DNA 合成仪用化学方法合成,不需要模板 以 mRNA 为模板,在逆转录酶作用下人工合成 ② 原理:DNA 双链复制 ②条件:模板 DNA、引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的 DNA 聚合酶 基因表达载体(重组质粒)的构建: ①基因表达载体的组成: ②构建过程: 载体〔质粒〕  同种限制酶或能产生一样末端的限制酶切割  含有目的基因的 DNA 片段 带有黏性末端 带有一样黏性末端〔或平末 〔或平末端〕的 端〕的目的基因片段 DNA 连接 重组 DNA 分子〔重组质粒〕 1 将目的基因导入受体细胞: 常用方法受体细胞 植物细胞 农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 受精卵、体细胞 动物细胞 显微注射技术 受精卵 微生物细胞 Ca2+处理法原核细胞 〔4〕目的基因的检测与鉴定 检测目的 目的基因是否插入转基因生物的 DNA 目的基因是否转录出了 mRNA  PCR PCR  检测方法  推断标准 目的基因是否翻译出蛋白质 个体水平的检测 抗原—抗体杂交技术 如抗虫、抗病的接种试验 是否消灭杂交带 是否表现出相应的特性 学问拓展： 限制酶的选择方法 依据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确 定限制酶的种类。 应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择 SmaⅠ。 为避开目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶〔非同尾酶〕切割目的基因 所在片段和质粒〔双酶切〕，如图甲可选择用 Pst Ⅰ和 EcoRⅠ两种限制酶〔但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点〕。 切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的全部标记基因，即至少要保存一个标记基因，以用于重组 DNA 的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。 标记基因的作用 标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞： 2 农杆菌转化法分析 农杆菌细胞内含有 Ti 质粒，当它侵染植物细胞后，能将 Ti 质粒上的 TDNA( 可转移的 DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上。 基因表达载体〔重组质粒〕导入农杆菌细胞时，要用 Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，有利 于重组质粒的导入。 将导入目的基因的受体细胞培育成完整的植株要用到植物组织培育技术。 DNA 的粗提取与鉴定 DNA 不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精 DNA 的溶解度DNA 在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度不同，它能溶于2 mol/L 的 DNA 的溶解度 O 0.14 mol/L NaCl 浓度 在肯定温度下，DNA 遇二苯胺试剂会呈现蓝色留意事项： 本试验不能用哺乳动物成熟的红细胞作试验材料，缘由是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无 DNA) 。可选用鸡血细胞作材料。 参加洗涤剂后，动作要轻缓、严峻，否则简洁产生大量的泡沫。参加酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成絮状沉淀 。 二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。 〔4〕提取植物细胞的 DNA 时，参加的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于 DNA 的释放；参加食盐(主要成分是 〔4〕提取植物细胞的 DNA 时，参加的洗涤剂能溶解细胞膜 NaCl)的目的是溶解DNA。 〔5〕在DNA 进一步提纯时，选用冷却的 95%的酒精 的作用是溶解杂质和析出DNA。 3 5、DNA 片段的扩增及电泳鉴定 过程 变性温度上升到 90 ℃左右，双链 DNA 解聚为单链复性延长温度下降到 55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 DNA 结合温度上升到 72 ℃左右，Taq 酶从引物起始合成互补链，可使链由 5′端向 3′端延长目的基因 DNA 受热变性后_解为单链，引物 与单链相应互补序列结合；然后以单链 DNA 为模板 DNA 聚合酶作用下进展延长 变性 温度上升到 90 ℃左右，双链 DNA 解聚为单链 复性 延长 温度下降到 55 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对 与两条单链 DNA 结合 温度上升到 72 ℃左右，Taq 酶从引物起始合成互补链，可使链由 5′端向 3′端延长 DNA 体外复制〔PCR〕的条件 参与的组分 DNA 母链 4 种脱氧核苷酸  供给 DNA 复制的模板合成 DNA 子链的原料  在 DNA 复制中的作用 引物 90℃以上高温 耐高温的 DNA 聚合酶缓冲液〔含 Mg2+) 其他不同的温度 使 DNA 聚合酶