EHS-M-W-0020生活饮用水中大肠菌群检测细则(多管发酵法).docx

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适用范围及标准 适用于生活饮用水、水源水、游泳池水中大肠菌群的测定。 技术标准 GB/T 5749-2023 《生活饮用水卫生标准》 GB/T 5750.12-2023 《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》 DB 31/890-2023《公共游泳场所卫生治理标准》 检测原理 总大肠菌群指一群在 37 ℃、24 h 培育能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 耐热大肠菌群指一群在 44.5 ℃仍能生长且发酵乳糖产酸、产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠埃希氏菌是指一群能生长发酵乳糖产酸、产气且在含有荧光底物的培育基上 44.5 ℃培育 24 h 产生β-葡萄糖醛酸酶,分解荧光底物释放出荧光产物,使培育基在紫外光下产生特征性荧光的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 仪器和设备 高压蒸汽灭菌器 3.2 冰箱:2 ℃—8 ℃ 3.3 恒温培育箱:36 ℃±1 ℃ 天平 PH 试纸 3.6 恒温水槽:44.5 ℃ 生物安全柜 紫外光灯:6W、波长 366nm 平皿:直径为 9cm 试管 刻度吸管 小倒管 金属接种环 培育基和试剂 乳糖蛋白胨培育基:称取乳糖蛋白胨于蒸馏水中加热溶解,充分混匀,分装到带有倒管的试管中(每管 10 mL), 115 ℃高压灭菌 20min。〔注:双料乳糖蛋白胨即蒸馏水不变,乳糖蛋白胨的成重量加双份。〕 伊红美兰琼脂平板:称取伊红美兰琼脂,加热溶解,倾注灭菌平皿,每皿约 15ml。冷凝后,倒置 4℃冰箱保存,待用。 革兰氏染色液〔染色方法见试剂使用说明书〕 EC 培育基:称取 EC 培育基干粉,加热溶解,调 PH 为 6.9±0.2,分装到带有倒管的试管中(每管 10ml),121 ℃高压灭菌 20 min,备用。 10 %〔m/m〕硫代硫酸钠溶液:121 ℃高压灭菌 20 min。 乳糖胆盐发酵培育管:称取乳糖胆盐,加热溶解,调PH 至 7.4,分装到带有倒管的试管中(每管 5 mL),115 ℃高压灭菌 15 min。〔注:双料乳糖胆盐发酵管即蒸馏水不变,乳糖胆盐加双份。〕 EC-MUG 管:称取本培育基干粉,加热溶解,在366nm 紫外光下检查无自发荧光后分装于试管中,115 ℃高压灭菌 20 min,最终 PH 为 6.9±0.2。 操作步骤 总大肠菌群 5 管法:无菌吸取 10 ml 水样参加双料乳糖蛋白胨培育液中,取 1 ml 水样参加单料乳糖蛋白胨培育液中,另取 1 ml 水样参加 9 ml 生理盐水中混匀作 10 倍稀释后取 1 ml(即 0.1 ml 水样)参加单料乳糖蛋白胨培育液中,每一稀释度接种 5 管。对已处理过的出厂自来水,需常常检验或每天检验一次的,可直接接种五管双料培育基,每管接种10 ml 水样。 15 管法:检验水源水时,如污染严峻的水样,应加大稀释倍数,可接种 1,0.1, 0.01 ml 甚至 0.1,0.01,0.001 ml,每个稀释度接种 5 管,每个水样共接种 15 管。接种1 ml 以下水样时,必需作 10 倍稀释后取 1 ml 接种。 轻摇试管,使液体充分混匀,置 36 ℃±1 ℃培育箱中培育 24 h。 观看每管是否产酸、产气,如不产酸也不产气则报告为大肠菌群阴性;假设液体变黄且有气体产生则为试验阳性,需做进一步的证明试验。 平板分别:自试验阳性管中取一接种环培育液,接种到伊红美兰琼脂平板上, 置 36 ℃±1 ℃培育箱中培育 18~24 h,观看菌落形态,典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色,具有金属光泽。 上海裕方检测技术作业指导书·检测细则 生活饮用水/游泳池水中大肠菌群检测细则 编号:EHS-M-W-002 章节:第 7 章,第 2 节修订:第 0 次修订 第 3 页,共 7 页 复发酵试验:挑取可疑大肠菌群菌落进展革兰氏染色,同时接种单料乳糖发酵管,置 36 ℃±1 ℃培育箱中培育 24 h。 结果报告:凡乳糖发酵管产酸、产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,为大肠菌群阳性。登记试验的阳性管数,查表得出 100 ml 水样中总大肠菌群的 MPN 值。15 管法结果见附表 1,5 管法结果见附表 2,稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。假设 全部乳糖发酵管阴性,则报告总大肠菌群未检出。 耐热大肠菌群 从测总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管〔产酸产气〕中无菌取 1~2 接种环菌液转种于 EC 培育基中,轻摇试管,使液体充分混匀,置恒温水浴箱中〔水浴箱的水面应高于试管中培育基的液面〕44.5 ℃培育 24±2 h。 假设只检测耐热大肠菌群时,可用直接多管耐热大肠菌群方法,即在第一步乳糖发酵试验时按《水中总大肠菌群检测细则〔多管发酵法〕》5.2.1 或 5.2..2 接种乳糖蛋白胨培育液,置恒温水浴箱中 44.5

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