重氮化偶合高效液相色谱法测定食品中亚硝酸盐.docxVIP

重氮化偶合高效液相色谱法测定食品中亚硝酸盐 亚硝酸盐作为世界著名的含有权利的疾病，它是自然形成的，在加工过程中产生的，并且被人为添加到许多食品中，应该引起人们的广泛关注。目前亚硝酸盐的检测方法有分光光度法 (比色法) 、示波极谱法、离子色谱法等。文献中尚未发现重氮化偶合高效液相色谱测定方法之类的报道。为此, 本文探讨了食品中亚硝酸盐含量的重氮化偶合高效液相色谱测定方法, 旨在提高亚硝酸盐检测的灵敏度、准确性和精密度, 以便对其进行更为有效的监控。 1 1.1 u3000酸、碱、质、量、液的配制 高效液相色谱仪Agilent 1100, 配紫外可见可变波长检测器 (VWD) ;二极管阵列检测器 (DAD) ;粉碎机;匀浆机;旋涡振荡器 (Minishaker, MS2) ;离心机 (Universal 32R) ;离心管 (带刻度, 50 mL) 。 冰乙酸:分析纯;甲醇:色谱纯。 氯化铵缓冲溶液:500mL容量瓶中加入250mL水, 准确加入10mL盐酸, 振荡混匀, 再准确加入25mL氨水, 用水稀释至刻度, 必要时用稀盐酸或稀氨水调至pH9.6～9.7。 硫酸锌溶液 (0.42mol/L) :称取60gZnSO 氢氧化钠溶液 (20g/L) :称取20g氢氧化钠, 用水溶解, 稀释至1L。 对氨基苯磺酸溶液:称取10g对氨基苯磺酸, 溶于700水和300冰乙酸中, 置于棕色瓶中保存。 N-1-萘基乙二胺溶液 (1g/L) :称取0.1g N-1-萘基乙二胺, 加入60%乙酸并稀释至100mL, 置于棕色瓶中保存。 显色剂:临用前将对氨基苯磺酸溶液和N-1-萘基乙二胺溶液 (1g/L) 等体积混合。 亚硝酸钠标准储备液:准确称取10.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠, 加水溶解移入100mL容量瓶, 加入20 mL氯化铵缓冲溶液, 加水定容至刻度, 混匀, 4℃避光保存。该储备液亚硝酸钠浓度为100μg/mL。 亚硝酸钠标准使用液:准确吸取上述标准储备液1.00 mL, 置于100 mL容量瓶中, 加水稀释定容至刻度。该使用液亚硝酸钠浓度为1.0μg/mL。 1.2 工艺溶液配制 称取2.50g经粉碎、匀浆混匀的样品, 置于离心管中, 加入15mL水, 3mL氢氧化钠溶液 (20g/L) , 调pH=8, 加入2.5mL硫酸锌溶液, 混匀。如无沉淀产生, 再补加0.5～2mL氢氧化钠溶液, 混匀。置于60℃水浴加热10min, 取出冷却至室温, 加水至刻度, 混匀。离心10min, 收集上清液备用。 1.3 氯化铵缓冲溶液的制备 吸取一定体积的亚硝酸钠标准溶液或1.2样品试液 (本实验样品试液取10 mL) , 置于25 mL带塞比色管中, 然后分别加入4.5 mL氯化铵缓冲溶液, 加2.5 mL60%乙酸后立即加入5.0mL显色剂, 加水至刻度, 混匀, 在暗处静置25min。 1.4 水系滤膜ld50 A液:乙酸水溶液 (14%) , 140mL冰乙酸溶于水中, 定容至1000mL, 过0.45μm水系滤膜。 B液:甲醇, 色谱纯。 色谱柱:Zorbax SB-C18, 4.6mm×150mm, 5μm。 进样量:20μL;进样方式:自动进样;柱温:30℃;VWD:波长544nm;DAD:Sig=205, 4;Ref=off。 1.5 定性分析方法 定性依据:DAD三维图谱分析, 结合VWD保留时间进行定性。 定量方法:标准曲线定量。 2 2.1 (1) 流动相的洗脱效果 根据偶合反应及偶合产物的特点, 选择乙酸溶液作为水相。分别以浓度为1%、5%、10%、15%、20%的乙酸溶液作为水相, 与甲醇组成流动相。结果显示, 10%、15%的乙酸溶液洗脱效果较好。然后以10%、11%、12%、13%、14%、15%的乙酸溶液试验, 结果显示, 14%的乙酸溶液洗脱效果最好。故选择14%的乙酸溶液作为流动相的水相。 (2) 偶合产物的筛选 有机相试选甲醇、乙腈、丙酮等, 分别与乙酸溶液按不同配比, 组成一系列流动相 (洗脱液) , 对1μg/mL亚硝酸盐标样偶合试液进行HPLC分析。结果显示, 选择乙腈和丙酮作有机相, 都不能将偶合产物洗脱开来。这可能与它们所含有的C=N和C=O双键破坏了偶合产物有关。而选择甲醇作有机相, 能够很好地将偶合产物洗脱并与杂质分离开来。 (3) 流动相的重氮化偶合产物的分离和色谱质谱 选择优化的乙酸溶液 (14%) 和甲醇 (B) , 分别以A、B之比为90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、50∶50组成流动相, 固定其他条件对1μg/mL亚硝酸盐标样的重氮化偶合产物进行分析。结果显示, 随着A液比例的增加, 色谱峰变宽, 而且变得拖尾, 灵敏度下降, 出峰时间推迟, 分