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耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因的研究 作为一种常见的临床感染病原体，它主要包括肺炎、呼吸困难、尿道炎症等疾病。目前，esbl和以各种药物治疗肺炎克雷伯菌感染的首选药物是碳绿霉素类抗生素。然而，近年来，由于碳绿霉素类抗生素的广泛应用，碳绿霉素类抗生素（crkp）的比例逐渐增加，呈现出全球传播的趋势，是抗感染治疗的严重威胁。 1 材料和方法 1.1 碳青霉烯类药物敏感菌株的筛选 收集2013年2月~2015年6月安徽医科大学第二附属医院临床标本中分离的非重复CRKP 44株。菌株经Vitek 2 compact全自动微生物鉴定药敏分析仪鉴定及药敏试验,按美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2013版标准判定,筛选出对碳青霉烯类药物非敏感菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和ATC-CBAA-1706购自卫生部临床检验中心。金属酶阳性菌株为产IMP-1型金属酶的铜绿假单胞菌。 1.2 材料和pcr引物 全自动微生物鉴定仪Vitek 2compact购自法国梅里埃公司;Flexcycler型梯度PCR扩增仪购自德国Analytikjena公司;Tanon1600型全自动凝胶成像分析系统购自上海天能科技有限公司;电泳仪购自美国Bio-red公司;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;PCR实验过程试剂、电泳用DNA Marker、PCR Master Mix(2×)等相关试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司;美洛培南纸片(10μg/片)和亚胺培南(30μg/片)购自英国Oxoid公司。 1.3 菌株检测及标准 采用法国梅里埃公司GN13鉴定药敏复合板进行常规药敏试验,检测抗菌药物包括:头孢曲松、头孢吡肟、头孢他啶、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、厄他培南,美洛培南用K-B法进行检测,大肠埃希菌ATCC25922作为质控菌株,操作方法及结果判断参照CLSI标准。 1.4 改善hough-key试验 1.5 edta协同试验检测金属酶 采用亚胺培南和乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)纸片的双纸片协同法。按K-B法涂布新鲜待测菌于MH琼脂平板,在MH琼脂平板一侧贴一张亚胺培南纸片(30μg/片),并将一张空白纸片贴在亚胺培南纸片另一侧,使两纸片边缘之间的距离为10~15 mm,然后在空白纸片上滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10μl,置35℃孵育24 h后观察结果,在含EDTA的空白纸片方向处亚胺培南抑菌圈扩大者,为协同试验阳性,可判定该菌株产金属β-内酰胺酶 1.6 碳青霉烯耐药基因 煮沸法提取细菌DNA,PCR方法扩增KPC-2及其他常见的碳青霉烯耐药基因如NDM-1、SME、OXA-48、GES、VIM、IMP等,PCR扩增引物条件参考文献 1.7 同源性分析中的染色dna 2 结果 2.1 标本类型及分布 44株菌株主要来自于重症监护室(ICU)(10例)、呼吸内科(6例)、神经内科(2例)、神经外科(13例)、急诊内科(2例)、急诊ICU(EICU)(4例)、泌尿外科(1例)、普外科(1例)、血液内科(4例)、肝病科(1例)等,标本类型为痰(31例)、尿液(7例)、全血(3例)、腹水(1例)、脑脊液(1例)及切口分泌物(1例)。 2.2 结果表明，抗癫痫药物的敏感试验 44株CRKP经药敏鉴定后均表现为对碳青霉烯类药物耐药,有95%以上的CRKP对头孢类药物耐药,见表2。 2.3 hough-key试验和edta合作试验的结果 44株肺炎克雷伯菌中改良Hodge试验阳性41株,阳性率93.2%,EDTA协同试验检测试验结果均为阴性。见图1。 2.4 抗癫痫基因试验的结果 PCR结果显示KPC-2阳性检出率最高为42株,见图2。未检出NDM-1、SME、IMP、OXA-48、VIM、GES阳性菌株。 2.5 同源度分析的结果 用ERIC-PCR的方法对44株CRKP DNA扩增,根据琼脂糖凝胶电泳的条带的结果进行基因分型,根据细菌同源性标准 3 改良hodge试验和碳青霉烯酶试验结果见表2 肺炎克雷伯菌感染在临床非常常见,通过翻阅临床病例资料,显示在感染肺炎克雷伯菌的患者里,大部分进行过有创性操作包括深静脉置管、气管插管、胃肠减压或者患有肠梗阻、肠穿孔等致肠道菌群明显异位的疾病,从而反映出肺炎克雷伯菌条件性致病菌的特点―易发生于免疫力低的老年人或婴幼儿、有基础疾病(糖尿病或肾病)、住院时间较长、接受有创性医疗操作的患者,特别是ICU的患者更是易感人群。通过每年细菌耐药网监测,碳青霉烯类药物在治疗肺炎克雷伯菌的同时也造成细菌耐药率逐年增高,C