铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物的分离鉴定及药敏分析.docxVIP

铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物的分离鉴定及药敏分析 铜绿假单胞菌是医院感染最常见的原因之一。碳青霉烯类抗菌药物在临床抗铜绿假单胞菌感染治疗中发挥了十分重要的作用,然而,铜绿假单胞菌耐碳青霉烯类抗菌药物临床分离株逐渐增多,并在不同地区、国家播散,对临床控制医院感染造成了严重的危害。铜绿假单胞菌耐药机制复杂,包括抗生素灭活酶或修饰酶的生成、外膜低渗透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主动外排等 1 材料和方法 1.1 非发酵菌株的分离和鉴定 2006年10~12月,从吉林市某医院烧伤病房8名患者的患部脓汁和血液中分离出8株非发酵菌,所有菌株经常规分离培养后,用Viteck系统鉴定确定为铜绿假单胞菌。 1.2 药敏纸片的选择 Taq DNA聚合酶,PCR反应缓冲液,d NTPs,琼脂糖,EDTA,MH培养基。药敏纸片:氨苄西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、亚胺培南(IMP)、氨曲南(AZT)、复方磺胺(SXT)、氯霉素(CHL),购自Oxoid公司。 1.3 药物过敏试验 1.3.1 菌株质控菌株 采用K-B法对常用的15种抗生素进行药物敏感性监测。标准质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853。根据临床实验室标准研究所(CLSI,2006)判读结果 1.3.2 mic值的测量 1.4 决定氨基酸b 采用双纸片增效法 1.5 金属酶基因与第一组血子的检测 1.5.1 提取的细菌总dna 1.5.2 引用设计 1.5.3 pcr反应 1.5.4 pcr产物序列的测量 2 结果 2.1 抗菌药物耐药情况 8株铜绿假单胞菌对β-内酰胺类药物,氨苄西林、替卡西林、替卡西林/克拉维酸和头孢唑啉,以及非β-内酰胺类抗菌药物药物,AMK、GEN、妥布霉素、SXT、四环素、CHI等15种抗菌药物耐药率均为100%。 2.2 mic检测 铜绿假单胞菌对头孢噻肟和头孢吡肟(MIC128μg/ml)、IMP和AZT(MIC 32~8μg/ml)表现高度耐药。 2.4 测试结果比较 以8株铜绿假单胞菌总DNA为模板,采用四种MBLs引物进行PCR扩增,只有VIM引物扩增出目标大小片段,VIM测序结果经DNAstar程序进行拼接和校对后,登陆Gen Bank数据库进行序列比较分析。比较结果发现与Pseudomonas aeruginosa(Gen Bank注册号:JN819277.1)核苷酸序列同源性100%,说明铜绿假单胞菌携带VIM-2型MBLs基因。 3 碳青霉烯酶耐药铜绿假单胞菌的检测 碳青霉烯类抗菌药物是一类广谱高效的β-内酰胺类抗菌药物。其抗菌谱广泛,抗菌活性强,对多数MBI(包括超广谱β-内酰胺酶和头孢菌素酶(Amp C酶)稳定,与第三代头孢菌素没有交叉耐药特性。临床上主要包括帕尼培南、IMP、厄他培南、美罗培南等,是临床上治疗铜绿假单胞菌多重耐药菌株感染的首选的抗菌药物,已成为治疗由革兰阴性菌多药耐药菌株引起严重感染的最后防线。IMP曾经是革兰阴性菌耐药率最低的,是治疗铜绿假单胞菌首选药物,但是随着碳青霉烯类抗菌药物的应用增多,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性也有所增加,且耐碳青霉烯类抗菌药物细菌大多数呈多重耐药,甚至广泛耐药 金属酶能水解大多数β-内酰胺抗菌药物,包括青霉素、头霉素、头孢菌素和碳青霉烯类(不包括氨曲南),其中以IMP和VIM型金属MBL最常见。VIM型金属MBL最早发现于意大利,在意大利维罗纳发现的VIM型金属MBL被命名为VIM-1型 本实验结果揭示了碳青霉烯类抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌在吉林地区烧伤病房流行,具有导致烧伤病房院内感染爆发流行的危险性。碳青霉烯类抗菌药物耐药的铜绿假单胞菌对头孢菌素类、四环素类等多种抗菌药物表现多重耐药。铜绿假单胞菌携带VIM-2基因决定对碳青霉烯类抗菌药物耐药。临床医疗大量使用碳青霉烯类抗菌药物加速铜绿假单胞菌借助可转移传递因子的扩散,是烧伤病房铜绿假单胞菌爆发流行的主要原因 本实验结果需要引起临床医生和临床微生物工作者的密切关注,应重视对多重耐药铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶的菌株同源性监测,防止同一克隆株的播散 根据K-B法初选耐药菌株,采用微量肉汤稀释法进行六种药物各15个浓度的体外药物体外抑菌活性(MIC)值的测定。结果判断依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)制定的指南。 根据文献方法提取铜绿假单胞菌临床分离株总DNA 下载NCBI数据库金属酶基因,采用DNAs-tar软件设计四对引物,送上海生工合成,见表1。 参考文献方法进行 提取PCR产物,用双脱氧链末端终止法进行测序。 2.3 ipm胶片增效法检测金属酶 采用双纸片增效法检测细菌产MBLs情况,结果显示:加EDTA的IPM纸片比不加EDT