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一种离体皮肤测试法在美白保湿美容中的应用 随着中国人民生活水平的提高，人们对美的追求也不断提高。皮肤美白和皮肤清洗一直是亚洲人最关心的皮肤健康和美丽的需求之一，深受消费者喜爱的补水产品也已成为消费者的焦点。目前美白护肤活性成分主要是通过抗氧化、抑制酪氨酸酶活性等机理实现美白效果，如广泛应用的维生素C和熊果苷等成分。烟酰胺是一种水溶性维生素，长期以来因为其消炎的作用而用于皮肤相关疾病的口服治疗。近年来的研究发现，将角质形成细胞与黑素细胞共同培养，烟酰胺能够阻碍黑素小体在黑素细胞与角质形成细胞间的传递 传统美白和保湿功效的研究多基于人体的临床测试，主要测试指标包括皮肤角质层含水量、皮肤黑红度、皮肤L Fontana-Masson染色作为黑色素最常用的染色方法，已被广泛应用在皮肤美白活性测试中 水通道蛋白3(AQP3）已被证实不仅具有高透水性，而且还可以作为甘油的有效转运载体 本研究通过离体皮肤模拟人体敷面膜的过程，采用Fontana-Masson染色，AQP3、Claudin-1和Filaggrin免疫荧光染色对自研面膜的美白和保湿功效进行测试，从而建立基于离体皮肤的美白和保湿功效测试方法。 1 实验部分 1.1 培养基和试剂 测试样品为本公司自研的烟酰胺细致提亮安瓶面膜（市售），安瓶部分为精华液，其中含有4%烟酰胺，面膜基材为由海藻纤维制成的高吸收性膜布。从一名接受包皮手术的健康男性捐献者（19岁）获得一块用于离体皮肤测试的皮肤组织。 面膜：自然堂烟酰胺细致提亮安瓶面膜（批号：232009152），伽蓝（集团）股份有限公司；DMEM培养基（货号，美国赛默飞世尔科技公司；AQP3（货号：sc-20811），圣克鲁斯生物技术（上海）有限公司；Filaggrin（货号：vp-F706），北京博蕾德生物科技有限公司；Fontana-Masson试剂盒（货号：ab150669）、Claudin-1（货号：ab211737）抗体、Goat Anti-Rabbit Ig G HL Alex flour 568（货号：ab175471）、Donkey Anti-Mouse Ig G HL Alexa Fluor 568（货号：ab175700）和DAPI（货号：ab104139），艾博抗（上海）贸易有限公司；青霉素（货号：41-501-25）、链霉素（货号：41-502-25）、两性霉素B（货号：03-029-1），广州华粤瑞科科学器材有限公司；O.C.T(optimal cutting temperature c o m p o u n d）冷冻切片包埋剂，德国徕卡公司。Scope.A1显微镜，德国蔡司集团。 1.2 实验方法 1.2.1 培养基皮肤制备 用灭菌后的剪刀和镊子将皮肤的脂肪层和多余的真皮层移除，使之均匀平整。采用DMEM和双倍的抗生素培养基（青霉素、链霉素和两性霉素B）冲洗皮肤2次，保证干净无杂质。采用皮肤圆环打孔器（直径5 mm）和锤子在皮肤上打孔，获得原片皮肤若干，将得到的皮肤圆片放在培养皿中，加少量上述培养基润湿真皮层，表皮层接触空气，形成空气液体交换界面。以上述方法将面膜打成同样大小的面膜圆片若干。 1.2.2 皮肤圆片的制备 分别设置空白对照组和面膜组，不使用面膜的皮肤圆片单纯培养作为空白对照组，使用面膜的皮肤圆片为面膜组。每组设置3个平行样本。面膜组的处理方法：将上述面膜圆片敷在大小一致的皮肤圆片上，尽量做到完整覆盖。每天贴1次面膜，每次15 min，随后涂抹3μL安瓶精华液，共使用5天。培养结束后，空白对照组和面膜组均采用质量分数10%的福尔马林固定液和O.C.T冷冻切片包埋剂固定分别处理皮肤圆片。用质量分数10%的福尔马林固定液处理的皮肤圆片经脱水、石蜡包埋制成石蜡切片；O.C.T固定放在-80℃制成冰冻切片。以备之后进行组化实验。 1.2.3 免疫荧光染色 采用Fontana-Masson染色法对制备好的空白对照组和面膜组石蜡切片进行染色，以探究样品的美白功效。采用Claudin-1抗体及Goat Anti-Rabbit Ig G HL Alex flour 568和DAPI进行免疫荧光染色，以探究样品的紧致锁水功效。采用AQP3抗体及Donkey Anti-Mouse Ig G HL Alex flour 568和DAPI进行免疫荧光染色，以探究样品的输水保湿功效。用荧光显微镜进行拍照。 1.2.4 染色照片的定量分析 采用I m a g e-P r o P r e m i e r 9.2(M e d i a Cybernetics，美国）图像处理软件对染色照片进行定量分析。采用SPSS Statistics 21.0(IBM，美国）数据处理软件进行数据分析。统计分析前对各参数进行正态分