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化学酶法制备盐酸甲氧那明工艺的改良 盐酸甲氧那明，也被称为甲氧苯丙胺钠酸盐（c）。 一般制备甲氧那明的方法是以2-甲氧基苯甲醛为起始物，在碱性条件下硝基乙烷与其发生缩合反应。在盐酸作用下，铁与三氯化铁将其还原成2-甲氧基苯丙酮，最后加入甲胺的盐酸盐，利用硼氢化钠还原胺化，继而制备得到盐酸甲氧那明 本文通过化学法与生物酶法的结合，采用化学酶法催化合成盐酸甲氧那明中间体2-甲氧基苯基异丙醇，再通过化学法制备最终成品，尽可能地减少有机溶剂等其他化学试剂的使用，避免采用氢化反应，提高制备安全性与环保经济性。 1 实验部分 1.1 dna提取、检测 Varian NMR-400 MHz型核磁共振仪，Waters液相检测器。 质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、DNA清洁试剂盒，均购自Axygen公司；限制性内切酶、DNA连接酶，均购自TaKaRa公司；全基因合成和基因测序，由杭州擎科梓熙生物技术有限公司提供；胰蛋白胨、酵母提取物，购自Oxoid公司。 醋酐（C 1.2 合成方法 1.2.1 催化合成质粒pet21de3 将来源于新鞘脂菌（Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444）的羰基还原酶（Short-chaindehydrogenase/reductase,SDR,GenBank:CP000677.1）由杭州擎科梓熙生物技术有限公司进行全基因合成，获得重组质粒pET28a-SDR，将此重组质粒转化到BL21(DE3）感受态细胞中，获得大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3）/pET28a-SDR。挑取单菌落接入50 mL含有卡那霉素的LB(5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl,pH 7.0）培养基中，37.0℃过夜培养。将8 mL过夜培养物接种于800 mL含有卡那霉素的TB(24 g/L酵母膏、12 g/L胰蛋白胨、5 g/L甘油、2.31 g/L KH 1.2.2 粗酶液的制备 在烧杯中加入30 g SDR菌泥，倒入50 mmol/L pH 7.0的PBS缓冲液至总体积为100 mL，振荡摇匀，重悬菌体，利用超声波破碎仪破壁30 min，即获得含有目的蛋白，浓度为300 g/L的SDR粗酶液。GDH粗酶液制备方法同上。 1.2.3 n-甲基蒂唑的合成 在室温条件下，1 L三口瓶中加入500 g醋酐，搅拌加入300 g 2-甲氧基苯乙酸（Ⅰ）并升温至60℃，搅拌30 min后，缓慢滴加30 g N-甲基咪唑，滴毕继续搅拌30 min后升温至130℃回流5 h，关停反应。减压蒸馏除去过量的醋酐，待冷却至室温后加入质量分数为30%的NaOH 300 mL，搅拌30 min后，加入DCM萃取3次，每次200 mL，合并的有机层用100 mL 2 mol/L的HCl洗涤后，常压蒸馏回收DCM，然后减压蒸馏，收集80～90℃（2 kPa）的馏分，得221 g 2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ） 核磁确证： 1.2.4 nad及质量分数 在圆底烧瓶中先后加入100 g底物2-甲氧基苯丙酮（Ⅱ）、1 000 mL水、165 g(1.5 eq）葡萄糖、250 mg 0.2 g/L的NAD、质量分数20%的Na 核磁确证： 1.2.5 -甲氧基苯基 氮气保护，取2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）50 g、三乙胺36.5 g(1.2 eq）、500 mL干燥的DCM,0℃环境下搅拌15 min，再开始滴加Ts Cl 68 g(1.2 eq），滴加完毕后继续搅拌30 min后恢复常温搅拌8 h。反应完毕后，用饱和NaHCO 取上述中间体1-(2-甲氧基苯基）-2-(4-甲基苯磺酸酯）-丙基（Ⅳ）50 g，溶于100 mL DMF中，后加入对甲苯磺酸32 g(1.2 eq）、甲胺乙醇溶液（质量分数33%)8 g(1.5 eq),60℃回流24 h。点板检测反应完毕。加入200 mL饱和Na 核磁确证： 1.2.6 盐酸甲氧那明的合成 在1 L三口瓶中加入90 g 2-甲氧基苯丙甲胺（Ⅴ）和500 mL无水丙酮，0～5℃下通入氯化氢气体2 h，有白色沉淀产生，抽滤，用丙酮洗涤，滤饼用乙醇甲苯混合溶剂重结晶，得78.9 g盐酸甲氧那明（Ⅵ） 核磁确证： 2 结果与讨论 2.1 影响2-甲基苯基异丙醇h纯度和阿波罗率的因素 2.1.1 氧化酶nad的量对纯度的影响 控制不同组别NAD当量，反应12 h取样测量产物2-甲氧基苯基异丙醇（Ⅲ）的纯度，结果如图1所示。 由图1可知，辅酶NAD的量控制在0.15～0.30 g/L区间，反应产物的纯度均能达到99.0%以上，继续加大其投量对纯度没有较大的提升，考虑到经济性，辅酶NAD的量应控制在控制在0.2 g/L。其对反应的收率影响较小。 2.1.2 投酶量对