基于荧光免疫层析技术快速评价新型冠状病毒肺炎病毒-cov-2抗体水平的方法.docxVIP

基于荧光免疫层析技术快速评价新型冠状病毒肺炎病毒-cov-2抗体水平的方法 2019年12月以来，一些医院相继报告了许多无法解释的肺炎。由于春节期间人口流动性很高，2020年1月该肺炎迅速传播到整个中国 目前对COVID-19患者的检测主要采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法、化学发光法以及胶体金法。荧光定量PCR法检测人体内提取出的核酸时灵敏度较低，容易出现假阴性，同时由于此类方法的检测时间长，对于检测环境的要求高，不宜于基层医院普及 SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白是一种丰富的RNA结合蛋白，可在病毒的生命周期中发挥多种作用 本研究基于NC蛋白建立了SARS-CoV-2抗体荧光免疫层析检测方法，通过对其精密度和稳定性进行评价，配合相应的荧光分析仪，实现了人体内SARS-CoV-2抗体水平的评价。整套系统操作简便，成本低廉，能够在15 min内即时完成检测，大大降低了检测时间，可有效提升复工复学群体的检测效率。 1 实验部分 1.1 微生物细胞的免疫 荧光微球(FMs, 美国Bangs Lab公司),1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(中国Aladdin公司),2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES)缓冲液、样品稀释液、包被液、微球保护液、微球封闭液、羊抗鼠IgG、鼠IgG、NF蛋白、BL21(DE3)/pET21b-NC菌株、SARS-CoV-2阴性样本和免疫NC抗原两周的兔血清(中国河南省生物工程技术研究中心)。 PVC板和吸水纸(中国通成纸业),玻璃纤维素膜(中国JY Biotech公司),XYZ三维点膜喷金仪和微电脑自动斩切机(中国上海金标生物科技有限公司),荧光免疫层析读数仪(中国杭州峰航科技有限公司),高电流电泳仪(美国Bio-Rad公司)。 1.2 鼠igg抗体结合原理 本实验采用双抗夹心法检测血清中SARS-CoV-2抗体的水平。将待测血清和样本稀释液按照一定比例混合后加入加样孔中，血清中的SARS-CoV-2抗体会和结合垫上的荧光标记抗原结合形成抗原-抗体复合物，并通过毛细作用沿着液体层析方向移动，随后通过层析作用逐渐在硝酸纤维素膜(NC膜)上移动，最后被固定在检测线(T线)上的包被抗原特异性地捕获，形成抗原-抗体-抗原复合物，而鼠IgG继续移动与质控线(C线)上的羊抗鼠IgG抗体结合。其原理如图1所示。当检测卡插入荧光检测仪后，仪器自动读取检测卡上T线和C线的荧光信号强度，T/C值可表示待测血清中SARS-CoV-2抗体的水平 1.3 培养基和培养基 1 ∶100接种菌株BL21(DE3)/pET21b-NC于1.2 L Luria-Bertani(LB)液体培养基中(含100 μg/mL 氨苄青霉素),37 ℃条件下振荡培养至OD 1.4 edc/mes溶液制备 取1%固含量的200 nm荧光微球40 μL于1.5 mL离心管中，加入1 mL纯化水后在15 000 r/min条件下离心15 min。弃上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)缓冲液振荡混匀，再加入10 mg/mL EDC溶液30 μL,振荡混匀，继续加入20 mg/mL NHS溶液80 μL,水浴超声 120 s混匀。将其置于台式恒温振荡器中避光活化30 min, 然后在15 000 r/min条件下离心15 min, 弃上清液后加入1 mL 20 mmol/L MES (pH 6.0)缓冲液，超声混匀。 1.5 鼠igg的模拟 在上述溶液中加入待标记抗原30 μg振荡混匀，避光条件下偶联1 h, 继续加入20 μg鼠IgG,避光条件下偶联1 h。偶联完成后，于15 000 r/min条件下离心15 min, 弃上清液，加入封闭液1 mL,超声混匀避光条件下封闭1 h。封闭完成的荧光微球于15 000 r/min条件下离心15 min, 弃上清液，加入微球保护液1 mL,超声混匀。 1.6 荧光微球偶联物的制备 将包被抗原和羊抗鼠IgG喷于硝酸纤维素膜的T线和C线上，质量浓度均为0.5 mg/mL,两带间隔4 mm, 置于真空干燥箱中抽真空干燥2 h。将制备的荧光微球偶联物稀释后用XYZ喷金划膜仪喷涂于结合垫上，置真空干燥箱中抽真空干燥5 h。将样品垫、结合垫以及吸水纸按照一定顺序组装在PVC板上，使用微电脑自动斩切机将组装好的PVC板切成宽度为3.9 mm的试纸条(试纸条结构示意图如图2所示),将试纸条装入特定的塑料检测卡中，以压卡机压紧检测卡上下盖，置于干燥房待用。 1.7 荧光免疫层析检测血清中ss-cov-2抗体基因型别 在室温下将待测血清和样本稀释液按照一定比例混合，用移液器吸取80 μL稀释后的血清，垂直悬空缓慢加入到样品垫上，15 min