无患子皂苷对自发性高血压大鼠血压、内皮损伤及相关炎症细胞因子的影响.docxVIP

无患子皂苷对自发性高血压大鼠血压、内皮损伤及相关炎症细胞因子的影响 无病儿童坦率是无病儿童科植物无病儿童树种的有效种子。有关无患子的药用在《本草拾遗》、《本草纲目》中均有记载, 性味苦平, 具有清热、解毒、祛痰等功效。本实验以此作为研究的出发点, 通过检测原发性高血压大鼠的尾动脉收缩压等指标考察无患子皂苷的降压效果;通过检测血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及血管内皮ICAM-1等炎症因子的表达, 考察其对内皮损伤及血管重构的保护机制, 为进一步深入研究该类药物的作用机制、完善中医治疗理论提供一定的科学依据。 1 实验材料 1.1 无患子总皂苷制备 无患子的成熟果实, 水洗、晾干、去籽、粉碎, 加12倍量水煎煮3次, 每次1 h。提取液过滤、浓缩, 上大孔吸附树脂柱, 依次用水、20%乙醇和70%乙醇洗脱, 收集70%乙醇洗脱液, 减压回收乙醇后以混合溶剂萃取, 即得淡棕色粉末, 为无患子总皂苷。以常春藤皂苷元为对照品, 紫外分光光度法测定, 无患子总皂苷质量分数为95.6%, 由安徽省化工研究院提供。 1.2 阳性对照药物 1.3 肿瘤死因子- 白细胞介素1β (IL-1β) 、白细胞介素-6 (IL-6) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 放免试剂盒, 均购于北京华英生物技术研究所, 批号ICAM-1兔抗鼠多克隆抗体, 购于北京中杉金桥生物技术有限公司, 批号:14520a。 1.4 精密检测仪器 BP-6无创动物血压测量系统 (成都泰盟科技有限公司) ;FA1004电子分析天平 (上海精密科学仪器有限公司) ;754紫外-可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司) ;80-2离心机 (上海手术器械厂) ;MK3全自动酶标分析仪 (上海弘联公司) ;电热恒温干燥箱 (上海三星电热仪器厂) ;Medlab U/4C501生物信号采集处理系统 (南京美易科技有限公司) ;Olympus BX51型光学显微镜 (日本Olympus公司) ;光学显微照相系统 (日本O-lympus公司) 。 1.5 实验动物 14周龄自发性高血压大鼠32只, 雌雄各半, 体质量 (200~250) g, 由北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 实验动物生产许可证号:SCXK (京) 2007-001;相同周龄健康Wistar大鼠8只, 雌雄各半, 体质量 (200~250) g, 由南京医科大学动物中心提供, 实验动物生产许可证号:SCXK (苏) 2008-0004。 1.6 实验设施 2 实验方法 2.1 动物分组及检测 取自发性高血压大鼠32只, 雌雄各半 (雌性未孕) , 体质量200~250 g, 适应实验室5 d, 每天测血压1次, 以使大鼠适应环境和检测刺激。然后称质量、编号, 随机均分为4组, 每组8只, 即自发性高血压大鼠模型对照组、阳性对照组 (卡托普利, 27 mg/kg) 、无患子皂苷低 (27 mg/kg) 、高剂量组 (108 mg/kg) 。另取8只健康Wistar大鼠作为正常对照组。各药物组大鼠分别按照上述剂量灌胃给药, 给药容积为1 m L/100g体质量, 正常对照组和自发性高血压大鼠模型对照组大鼠灌胃等容量蒸馏水, 给药时间持续8周。 2.2 大鼠易激接情况 期间, 观察大鼠的精神、饮水、摄食、排便、毛色、体质量、活动度等情况。大鼠易激惹程度分为Ⅲ级:Ⅰ级指捉持大鼠颈部时无明显反应;Ⅱ级指捉持大鼠颈部时尖叫、惊跳;Ⅲ级指捉持大鼠颈部时咬人或同笼大鼠频繁打斗。 2.3 首次药前后大鼠血压情况 用Bp-6无创血压测量系统测定大鼠尾动脉收缩压。在大鼠安静状态下, 连续测收缩压3次, 取平均值作为测压结果。观察指标: (1) 单次给药降压效果, 测给药前大鼠血压、首次药后30、60、90、120、240 min的血压情况; (2) 连续给药降压情况, 分别测定1、4、7、10、13、16、19、22、25、28、35、42、49、56 d药后30 min血压 (由单次给药结果可知, 无患子皂苷高剂量组在药后30 min开始起效) , 每天重复测量3次, 取所得平均值作为最终的血压值。 2.4 血管内皮内皮细胞的表达分析 末次药后待血压测定完成后, 用20%乌拉坦腹腔麻醉, 腹主动脉取血4 m L, 静置、分离血清, 放免法检测血清IL-1、IL-6、TNF-α水平, 实验方法严格按照试剂盒说明书进行操作。取腹主动脉血管置入福尔马林中固定、脱水透明、包埋切片, 免疫组化法检测血管内皮ICAM-1的表达水平, 以光镜下观察到内皮细胞胞浆及间质内黄色、棕黄色或棕褐色颗粒状物质为阳性表达, 按阳性染色细胞所占比例分为3级:阳性染色细胞占15%~35%为弱阳性反应 (+) ;阳性染色细胞占36%