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矿源性黄腐酸的急性毒性和遗传毒性试验 随着人民生活水平的提高，食品安全问题越来越受到重视，抗生素滥用问题逐渐成为限制我国畜牧养殖业发展的主要问题之一。近年来, 国内外已对抗生素促生长剂替代品进行了较为广泛的试验研究, 益生素、有机酸、低聚糖、抗菌肽、酶制剂和植物提取物等天然产品都受到广泛关注。 研究表明, 从天然褐煤、风化煤中提取的腐植酸 1 材料和方法 1.1 样品和试剂的测试 矿源黄腐酸, 黄腐酸含量为12.05% 1.2 个级别 ICR小鼠, 体重分为18~22、25~30、25~35 g 3个级别;SD大鼠, 体重180~200 g, 均购自北京维通利华动物科技有限公司, 试验动物合格证号:SCXK (京) 2007-0001。 1.3 试验地点 1.4 测试方法 1.4.1 灌胃法试验总模型 通过预试结果确定染毒剂量为5 000 mg/kg体重。将ICR小鼠、SD大鼠各30只分别随机分为3组, 每组10只 (雌、雄各半) 。每次取1组进行试验, 重复3次。用1%羧甲基纤维素钠将黄腐酸原粉配制成混悬液, 以经口灌胃法对分别对ICR小鼠和SD大鼠进行染毒。灌胃体积为ICR小鼠0.2 m L/10 g体重, SD大鼠2 m L/100g体重。染毒后观察小鼠和大鼠的一般表现、中毒症状和死亡情况, 并对死亡小鼠和大鼠进行剖检, 做好记录。观察期为1周。 1.4.2 遗传毒性试验 1.4.2. 正式试验分组 根据受试物预试验结果 (其最大溶解度为100μg/10μL, 且预试验未见细菌毒性) , 正式试验分为1 000、200、40、8、1.6μg/100μL 5个剂量组, 同时设2个阴性对照组 (灭菌蒸馏水、二甲基亚砜) 和1个阳性对照组。TA 1.4.2. 实验动物的分组与处理 试验设5 000 mg/kg体重 (高) 、2 500 mg/kg (中) 、1 250 mg/kg (低) 3个剂量组, 另设1个阳性对照组和1个阴性 (溶剂) 对照组。阳性对照物选用环磷酰胺, 按40 mg/kg体重剂量经腹腔注射法给予。分别将100只小鼠分为5组, 每组20只 (雌、雄各半) 进行试验。用1%羧甲基纤维素钠将黄腐酸原粉配制成各测试浓度的混悬液, 采用经口灌胃法对实验动物进行染毒;阳性对照组按2 mg/m L剂量采用腹腔注射法对实验动物进行染毒;阴性对照组用1%羧甲基纤维素钠进行灌胃。小鼠灌胃体积为0.2 m L/10 g体重;腹腔注射体积为0.2 m L/10 g体重, 每天1次;连续2 d给药。最后1次给予受试物6 h后以颈椎脱臼法处死雌雄小鼠, 取股骨骨髓制片。以双盲法镜下检查计数嗜多染红细胞数 (PCE) 、含微核嗜多染红细胞数及成熟红细胞数 (RBC) , 做好记录。 1.4.2. 小鼠的毒副反应 试验设5 000 mg/kg体重 (高) 、2 500 mg/kg (中) 、1 250 mg/kg (低) 3个剂量组, 另设1个阳性对照组和1个阴性 (溶剂) 对照组。阳性对照组选用环磷酰胺, 按40 mg/kg体重剂量给予。将50只雄性ICR小鼠随机分为5组, 每组10只进行试验。用1%羧甲基纤维素钠将黄腐酸原粉配制成各测试浓度的混悬液, 采用经口灌胃法进行染毒;阳性对照组按2 mg/m L剂量采用腹腔注射法进行染毒;阴性对照组用1%羧甲基纤维素钠进行灌胃。小鼠灌胃体积为0.2 m L/10 g体重;腹腔注射体积为0.2 m L/10 g体重, 每天1次;连续5 d, 间隔24 h。在首次染毒后第35天以颈椎脱臼法处死小鼠, 摘取两侧附睾按标准操作方法制片。在显微镜下检查精子形态, 对同一视野下正常精子、各型畸形精子进行计数, 做好记录。 1.5 精子畸形试验检测方法建立 试验数据用Microsoft Excel软件和SPSS软件建立数据库, 计量资料采用t检验, 计数资料采用非参数统计法, 每个剂量组分别与相应的阴性对照组比较, 用卡方检验方法评价精子畸形阳性率和微核率, 并按动物性别分别统计。 2 结果 2.1 大鼠急性毒性试验ld ICR小鼠和SD大鼠在1周的试验观察期内无临床中毒症状, 未见死亡。经口LD 2.2 遗传毒性试验 2.2.1 沙门氏菌回归反应pmes试验 TA 2.2.2 小鼠骨髓细胞微核试验结果 由表3和表4可以看出, 阳性对照组2种性别小鼠骨髓细胞中含微核嗜多染红细胞率极显著高于阴性对照组相应性别的含微核嗜多染红细胞率 (P0.01) , 而黄腐酸原粉各剂量组雌、雄小鼠骨髓含微核嗜多染红细胞率与阴性 (溶剂) 对照组比较无显著性差异 (P0.05) , 且各试验组嗜多染红细胞 (PCE) 与成熟红细胞 (RBC) 比值 (PCE/RBC) 在正常范围内, 表明黄腐酸原粉在1 250~5 000