合成冬虫夏草诱发沙门氏菌基因突变的ames试验研究.docxVIP

合成冬虫夏草诱发沙门氏菌基因突变的ames试验研究 婆罗洲的起源有两种类型：天然婆罗洲和合成婆罗洲。天然冰片多为龙脑香科植物龙脑香树脂的加工结晶品;合成冰片, 是以樟脑、松节油为主要原料, 经化学方法合成的精制品, 又名机片。合成冰片除含有龙脑外, 还含有大量龙脑的差向异构体———异龙脑 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细粉末制备工艺 合成冰片由天津天士力制药股份有限公司提供, 批号 试验前将合成冰片研磨成细粉末, 过140目筛, 临用前用二甲基亚砜 (DMSO) 配制成不同浓度受试液。 1.1.2 羟基1,8-a 敌克松 (Dexon) ;二氨基芴 (2-AF) ;1, 8-二羟基蒽醌 (1, 8-Dan) , 来源:美国Sigma公司, 用DMSO配制, 2～8℃保存, 所有接触阳性对照剂的试验物品, 如平皿、试管等均用专用塑料袋封装, 按同位素垃圾处理方式处理 1.1.3 s9代谢激活系统的制备 肝脏微粒体酶 (S9) 活化系统的制备依照Ames法 1.1.4 tal00和taol2ce的构建 采用组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TAl00和TAl02共4株标准菌株 (由北京军事医学科学院毒理研究所惠赠) 。试验菌株遗传特性 (组氨酸需求、rfa突变、紫外线敏感、氨苄青霉素抗性、四环素抗性) 经鉴定均符合试验要求。 1.1.5 两组氨酸、生物素的含量 顶层培养基:0.6%纯琼脂, 含0.5%NaCl, 0.05 mol/L组氨酸或生物素。底层培养基:1.5%琼脂水溶液, 含2%葡萄糖和10倍Vogel-Bonner培养基 (V-B储存液) , 每500 mL琼脂水溶液中10倍V-B储存液占100 mL。 1.2 方法 1.2.1 梯度稀释使受试物作用 将合成冰片以DMSO配制成10 g/L的母液, 梯度稀释使受试物作用于TA98和TAl00测试菌株的终浓度为1 000、500、250μg/皿。每测试浓度在活化和非活化条件下各做3个平皿。 1.2.2 物的诱导诱导 试验同时设溶剂对照组 (+/-S9mix) 、空白 (即自发回变) 对照组 (+/-S9mix) , 以及阳性诱变剂对照组, 阳性物包括直接诱变剂敌克松 (50.0μg/皿) ———在无S9活化系统时作用于4株菌, 间接诱变剂2-氨基芴 (20.0μg/皿) ———在有S9活化系统时作用于TA97、TA98、TAl00, 间接诱变剂1, 8-二羟基蒽醌 (50.0μg/皿) ———在有S9活化系统时作用于TAl02。 共进行3批试验, 每批试验每1浓度测试点在活化和非活化条件下各做两个平行平皿。计算3批试验的平均值。 1.2.4 回复突变菌落数测定 按《新药 (中药) 临床前研究指导原则》, 如在1个或1个以上测试浓度诱发的回复突变菌落数比溶剂对照增加1倍以上, 且具有剂量依赖关系, 可判为阳性反应。任何菌株出现上述阳性反应时, 均可判为试验结果阳性。 2 结果 2.1 合成晶片检测 用TA98、TA100作为测试菌株进行的预试验结果显示, 在1 000μg/皿以上受试浓度下, 当将合成冰片加入试验系统时出现不同程度的白色析出, 并且合成冰片在500μg/皿以上测试浓度下出现抑菌作用, 据此, 将受试物的最大测试浓度定为250μg/皿, 按等比递减原则, 将诱变试验中合成冰片受试浓度设置为250, 50, 10, 2和0.4μg/皿。 2.2 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验结果 经过48 h的培养后, 各剂量组的标准测试株菌苔生长情况良好。结果见表1。 由表1可见, 各试验菌株自发回变率均在正常范围, 各菌株对相应的诊断性诱变剂均获得明确的阳性反应, 说明试验系统可靠。合成冰片250、50、10、2和0.4μg/皿各剂量组, 无论在加与不加S9活化系统条件下, 对鼠伤寒沙门氏组氨酸合成缺陷菌株TA97、TA98、TAl00和TAl02回复突变的菌落数均在正常范围内, 与溶剂 (DMSO) 对照相比均无明显增加, 即均未超过溶剂对照的两倍。可认为合成冰片对4株标准测试菌株均未显示致突变性, Ames试验结果阴性。 3 合成热法药物的安全性 Ames试验是1975年由美国加州大学生物化学教授Ames B.N.首次完整提出的 突变 (mutation) 是指微生物基因组的核酸序列发生可遗传的改变 本试验中, 在加与不加S9活化系统的两种条件下, 合成冰片在0.4～250μg/皿浓度范围内对TA97、TA98、TAl00和TAl02均未体现出诱发回变菌落数增加作用, 合成冰片在Ames试验中无致突变作用, 且不同受试药物之间回变菌落数没有明显的变化规律, 提示合成冰片可能无诱发测试菌株发生基因突变的作用, 该药具有临床应