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衣藻不运动突变体if79的基因克隆与分析 例如，高度保守的细胞通常存在于真核生物细胞中，这与信号转导和动物发育密切相关。正确监测和维持雇主的组装、凝聚力、定制和保存。缺点往往导致一些疾病。在人体中，滥用职权的劣势包括多囊肾病（pmd）和肾原毛（pcd）引起的各种疾病。 IFT复合体高度保守且由两个亚复合体组成,分别为IFT-A和IFT-B. IFT-B复合体的核心蛋白包括IFT70、IFT46、IFT88、IFT81、FT74 /72、IFT52、IFT22、 IFT25及IFT27 IFT-B复合体与鞭毛内的正向运输紧密相关,相关蛋白缺陷常常造成鞭毛组装障碍,如IFT46或者IFT88缺陷引起的短鞭毛或无鞭毛突变 单细胞真 核生物莱 茵衣藻 ( Chlamydomonas reinhardtii) 作为一种模式生物,常用于研究鞭毛组装和解聚的机制. 然而,莱茵衣藻鞭毛内运输蛋白IFT81参与调控鞭毛组装尚未见突变体分析. 本文通过插入突变的方法,筛选出了不运动突变体ift81,序列分析发现是IFT81基因缺陷. 对该突变体的分析显示IFT81基因缺陷导致衣藻鞭毛变短或丧失,进一步的蛋白定位和显微结构观察证实IFT81蛋白在鞭毛组装过程中具有重要功能,这为揭示IFT81蛋白调控鞭毛组装机理提供了基础数据. 1 材料和方法 1.1 抗体主题材料 野生型莱茵衣藻株21gr ( mt + ) ( CC-1690) 购自美国明尼 苏达大学 衣藻中心. 抗体anti-α-tubulin ( 1∶ 2500) 购自美国Sigma公司. 抗体rat anti-HA ( 1∶ 4000) 购自瑞士Roche公司. 抗体mouse antiIFT81 ( 1 ∶ 1000 ) 由University of Idaho的Dr. Cole惠赠. 1.2 细胞培养条件 衣藻细胞培养于液体培养基,培养温度为23 ~ 24 ℃ . 培养条件为: R液体培养基连续光培养S /0代 ( 即直接从平板上挑取并转移到液体培养基培养的细胞) ,3 ~ 5 d后转接至M液体培养基 1.3 突变体安全性评估原理 按照Liang和Pan 将线性化的外源片段aphⅧ( 巴龙霉素抗性基因) 导入野生型莱茵衣藻细胞中,从众多转化子中筛选获得运动缺陷突变体,应用限制性内切酶定点扩增PCR ( restriction enzyme site-directed amplification PCR, RESDA-PCR) 鉴定外源片段在突变体衣藻基因组中的插入位置 通过PCR方式从野生型衣藻基因组DNA中克隆5. 5 kb的含有完整IFT81基因( 不包括终止密码子) 和IFT81基因的内源性启动子( 1. 3 kb) 的片段,再将一个与终止子相连的3 × HA ( haemagglutinin,血凝素) 蛋白标签加在5. 5 kb的基因序列之后,最后选择一个含有潮霉素 ( Hygromycin B) 抗性基因 的表达载 体 1.4 聚丙烯酸凝胶电泳和蛋白质免疫印花 聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹实验采用Wang等 1.5 荧光和荧光试验 采用Wang等 2 结果与讨论 2.1 突变体鞭毛的形态 为获得衣藻不运动突变体,通过电转化的方式将外源DNA片段aphⅧ导入野生型衣藻21gr细胞之中. 从3000个转化子中,筛选获得运动缺陷突变体7个, 将其中的一株不运动突变体命名为af13-24. 野生型21gr细胞,有两个等长的鞭毛,其长度大约是12 μm,见图1( a) . 与野生型细胞不同,大部分突变体细胞在细胞分裂完成后不能正常分开,在液体培养基中细胞呈现出聚团生长的现象. 在这些细胞团中,可以明显观察到短鞭毛的存在,见图1( b) . 经过细胞壁溶解酶处理,突变体细胞可以从细胞团中分散开,单个的突变体细胞呈现出无鞭毛或者短鞭毛的多种性状,图1( c) ~ ( f) . 为了进一步分析突变体鞭毛的长度特征,用细胞壁溶解酶处理获得分散的突变体细胞后统计鞭毛的长度分布,见图1( g) . 在所有突变体细胞中,无鞭毛的细胞占57% 左右,鞭毛长度0 ~ 1 μm的细胞大约有20% ,鞭毛长度1 ~ 2 μm的细胞有17% 左右,鞭毛长度2 ~ 3 μm的细胞约为4. 5% ,鞭毛长度3 ~ 4 μm的细胞少于1. 5% . 与突变体不同的是,野生型21gr细胞的两根等长的鞭毛主要分布于11 ~ 14 μm之间,70% 左右细胞的鞭毛都在11 ~ 14 μm; 只有很少的细胞鞭毛长度是小于11 μm或者大于14 μm. 这些结果显示,不运动突变体衣藻af13-24是一种短鞭毛或鞭毛缺失突变. 2.2 突变体af13-24的aft81基因缺陷 为了确定突变基因,将突变体基因组的RESDAP