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三氯生的体外遗传毒性研究 三氯生（ts）由于其高度光谱和高效率，自1968年以来，它被广泛用于医疗消毒和肥皂、消毒剂、牙膏和其他个人护理和家庭用品。 环境中的TCS可通过直接和间接的方式进入生物体内, 已有研究报道在人体的血清/血浆、尿液、大脑、肝脏及脂肪组织内可检测到TCS 欧美各国已经逐步限制TCS在各类产品中的使用 1 材料和方法 1.1 菌株的来源和遗传特征的测定 TK6细胞和鼠伤寒沙门氏菌TA98、TA100和YG7108 (Ogt 1.2 测试对象 三氯生, CAS号3380-34-5, 购自美国SigmaAldrich公司。 1.3 酶活剂 喜树碱 (camptothecin, CPT) , CAS号7689-03-4, 购自梯希爱 (TCI, 上海) 化成工业发展有限公司, 终浓度20μmol/L。丝裂霉素C (mitomycin C, MMC) , CAS号50-07-7, 购自Roche公司, 终浓度0.5μg/m L。TA98菌株阳性对照采用2-硝基芴 (2-nitrofluorene, 2-NF) , CAS号607-57-8, 终浓度20μg/皿;TA100和YG7108菌株阳性对照采用甲磺酸甲酯 (methyl methanesulfonate, MMS) , CAS号66-27-3, 终浓度分别为13 000和200μg/皿。2-NF和MMS均购自Sigma-Aldrich公司。 1.4 细胞培养和复孔加药处理 TK6细胞用含10%马血清 (Gibco公司, 货号16050-122) 的RPMI-1640 (Corning公司, 货号10-040-CVR) 培养基于37℃、CO 每个复孔加药处理细胞5 m L, 每个浓度分别取2.5m L加在6孔细胞培养板内, 共2块, 一块用于彗星试验, 另一块用于微核试验。在用于微核试验的6孔细胞培养板内加入细胞松弛素B (cytochalasin B) , 终浓度为3μg/m L, 与TCS共同处理TK6细胞24 h。 1.5 脂糖凝胶裂解 给药处理24 h后, 离心除去培养液。然后用HBSS/EDTA缓冲液清洗1次。在载玻片上制备胶体, 先用1%的常熔点琼脂糖凝胶铺第一层胶, 待凝固后, 将混合均匀的细胞悬液与0.7%的低熔点琼脂糖凝胶铺在第一层胶上, 凝固后在4℃下裂解1.5 h。裂解完毕后转移至碱性电泳缓冲液中, 静置40 min后在300 m A下电泳20 min。电泳完毕后, 用0.4 mol/L Tris-HCl中和, 无水乙醇脱水, 干燥后用1μg/m L的DAPI染色10min, 在荧光显微镜下观察细胞形成的DNA彗星拖尾情况, 用专业软件COMET IV (Perceptive Instruments, Version 4.3) 实时图像测定系统进行分析, 每个剂量组分析100个细胞图像 (每个复孔分析50个, 2个复孔合计分析100个) , 测定彗星的尾长、尾部DNA强度和尾矩。 1.6 体外细胞毒性检测 给药处理24 h后, 离心除去培养液。加入0.075mol/L KCl低渗5 min, 然后加预冷的固定液 (甲醇∶冰醋酸=3∶1) 混匀, 离心弃上清。加入固定液固定15min后离心 (重复1次) , 弃上清 (留适量液体) , 重悬混匀后滴片。待自然干燥后, 用PBS配制10%Giemsa染色15 min, 冲洗, 晾干。显微镜观察标本: (1) 每个剂量组计数500个细胞 (每个复孔的标本计数250个, 2个复孔合计500个) , 分别计数单核、双核、三核和四核的细胞数, 用于计算各剂量产生的细胞毒性。根据经济合作与发展组织 (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD) 指导原则 细胞毒性 (%) =[1- (CBPI 1.7 细菌毒性试验 使用DMSO配制不同浓度的TCS。实验设定0.000 5、0.001 67、0.005、0.016 7、0.05、0.167、0.5和1.67μg/皿共8个剂量组, 同时设定阴性对照组 (每块平皿加入100μL DMSO) 和阳性对照组, 每个剂量3块培养皿。将TA98、TA100和YG7108菌株接种在营养肉汤培养基中, 在37℃恒温水浴摇床过夜进行扩增。取100μL的TCS受试物药液、100μL菌液、0.5 m L PBS和2.0 m L的顶层培养基于试管中, 振荡混匀后铺于底层培养基。37℃恒温培养箱培养2~3 d取出培养皿, 用肉眼观察回复突变菌落进行计数;观察背景菌斑, 考察各剂量TCS对菌株的细菌毒性。毒性表现: (1) 背景菌斑与阴性对照相比若减少或消失; (2) 测试组的回复突变菌落数与阴性对照