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芳樟醇对大肠杆菌的抑菌机制研究 芳樟醇是一种也被称为李那醇的链醇。它属于r-和s-层。无色液体，具有铃兰香气，它是香水、清洁去污产品中使用频率最高的香料，也可用作食用香精以及工业生产中的重要中间体。除此之外，诸多体内外实验研究表明芳樟醇具有镇痛、抗焦虑、镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、抗菌等活性，在医药、食品领域应用前景十分广阔 食品腐败主要是由微生物引起的，微生物通过各种代谢活动产生不良气味以及有毒代谢产物。兼性病原体引起的食品污染是目前食品工业面临的一个严峻挑战 目前，食品防腐主要是通过添加化学合成的防腐剂来实现的，但是化学合成的防腐剂具有一定毒性。出于对化学合成防腐剂安全问题的担心，人们对天然植物精油的防腐功能产生了浓厚的兴趣，并在食品防腐保鲜方面进行了广泛研究 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 培养基和试剂 大肠杆菌(ATCC8739)，广东省微生物菌种保藏中心；芳樟醇≥99%，海南康馥纳生物有限公司；营养肉汤培养基，北京陆桥生物技术有限责任公司；琼脂、无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ATP含量测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；罗丹明123，上海源叶生物科技有限公司。 1.1.2 仪器、试药与仪器 SP-Max3500FL型多功能酶标仪，上海闪谱生物科技公；Christ Alpha1型冷冻干燥机，德国Marin Christ公司；GI54DS型高压灭菌锅，致微仪器有限公司；S-3000型扫描式电子显微镜，日本日立(Hitachi)工机有限公司；JYD-650L型超声波细胞粉碎机，上海五相仪器仪表有限公司；SPX-288型生化培养箱，宁波江南仪器厂；TU1810型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SW-CJ-1FD型无菌超净工作台，苏州佳宝净化工程设备有限公司；SHA-2型恒温振荡器，常州澳华仪器有限公。 1.2 方法 1.2.1 菌悬液的制备 大肠杆菌接种至营养琼脂培养基中，37℃，180r/min传代活化18～24 h，将培养后的菌株用0.9%的生理盐水冲洗形成菌悬液，采用麦氏比浊法调整菌液浓度至1×10 1.2.2 最小抗菌浓度mic的测量 参照Filomena S等人 1.2.3 生长曲线的测量 将培养至对数期的大肠杆菌用0.9%的生理盐水稀释至1×10 1.2.4 扫描电子显微镜sem 细胞形态的观察参考Yi L等人 1.2.5 膜电位 膜电位的测定参考张赟彬 1.2.6 培养基的制备 采用BCA试剂盒测定胞内蛋白含量。将经1.2.1活化后培养至对数期的菌悬液加入含有1×MIC、2×MIC芳樟醇的培养基中，并以无菌水和1%DMSO做空白和阴性对照。以2 h为取样时间间隔，将取出的菌悬液6000 r/min离心10 min,0.01 mol/L PBS洗涤三次并重悬，将重悬后的菌体低温超声破碎(功率300 W，间隔1.1 s)后，8000 r/min离心10 min，取上清液，用BCA试剂盒测定样品的蛋白含量。 1.2.7 测定了原子能浓度 核酸浓度的测定依据Cui H等人 1.2.8 dmso测定 将经1.2.1活化后培养至对数期的菌悬液加入含有1×MIC、2×MIC芳樟醇的培养基中，并以无菌水和1%DMSO做空白和阴性对照。以2 h为取样时间间隔，将取出的菌悬液6000 r/min离心10 min,0.01mol/LPBS洗涤三次并重悬，将重悬后的菌体低温超声破碎(功率300 W，间隔1.1 s)后，8000 r/min离心10min，弃细胞残渣，取上清液，用ATP含量测试盒测定ATP含量。 1.3 处理数据 所有实验均重复3次，数据处理采用DPS软件进行差异显著性分析(p0.05)，绘图采用Origin软件。 2 结果与分析 2.1 芳樟醇对大肠杆菌生长的抑制作用 由表1可知，芳樟醇对大肠杆菌具有显著的抑菌作用，抑菌效果随芳樟醇浓度增大而增加，在芳樟醇浓度为5 m L/L时无大肠杆菌菌落生长，而2.5 m L/L时有较少菌落生长，所以芳樟醇对大肠杆菌的最小抑菌浓度为5 mL/L，并且空白组和阴性对照组对大肠杆菌的生长无抑制作用。 2.2 醇对大肠杆菌的抑制作用 菌液中菌体浓度可以由600 nm处的吸光值反映，吸光值越大菌体浓度越高，由此可以反映芳樟醇对大肠杆菌的抑制作用。由图1可知，空白组和阴性对照组细菌呈现典型的“S”型生长，说明细菌生长状况良好。0.2×MIC组较空白组和阴性对照组OD值增长幅度明显减小，而1×MIC、2×MIC组细菌OD值几乎无变化，说明芳樟醇可以有效减缓甚至完全抑制细菌的生长。这与沈妍 2.3 各组大肠杆菌细胞形态正常 为了更直观地显示细胞形态，采用扫描电镜对经芳樟醇处理后的大肠杆菌进