1,3-丙二醇发酵甘油合成甘油脱水酶的研究.docxVIP

1,3-丙二醇发酵甘油合成甘油脱水酶的研究 1 甘油及甘油脱水酶 1.3-丙二醇（1.3-propalm，以下简称1.3-pd）是重要的化工原料和化工材料。广泛应用于有机溶剂和添加剂中，尤其是用作单体合成聚醚、聚醚、聚醚等材料的材料。 自然界中很多种微生物, 如弗氏柠檬酸菌 (Citrobacter freundii) 、丁酸梭菌 (Clostridium butyricumclostrium) 、克氏肺炎杆菌 (Klebsiella pneumoniae) 等都能通过发酵甘油合成1, 3-PD 甘油脱水酶是甘油转化为1, 3-PD过程中的限速酶, 它必须在辅酶VB 本工作针对Klebsiella pneumoniae发酵甘油后期合成1, 3-PD速率下降快的问题, 较为系统地研究了外加能量对产物合成和甘油脱水酶活性的影响. 2 材料和方法 2.1 种子培养基和活性培养基 实验用菌种为克氏肺炎杆菌Klebsiella pneumoniae L1 (K.pneumoniae L1) , 中国农业大学赠送. 好氧种子培养基碳源为葡萄糖, 初始浓度20 g/L;厌氧发酵培养基碳源为甘油, 初始浓度20g/L, 其它组分同文献[3].K.pneumoniae L1先好氧培养6～8 h, 使OD 2.2 磷酸钾缓冲液体系 在厌氧培养基中添加适量ATPNa 将厌氧培养指数生长期后期 (约20 h) 的发酵液离心收集菌体, 取适量加入30 mmol/L磷酸钾缓冲液 (pH 8.0) 体系, 使体系组成为:辅酶VB 2.3 生物量的测量 菌体浓度通过测定发酵液在650 nm处的吸光度值OD 2.43 -hpa的测量 甘油转化为1, 3-PD过程的中间产物3-HPA的测定借鉴甘油脱水酶酶活分析方法 2.5 高效液相色谱法测定 发酵液中的甘油、1, 3-PD及副产物乙酸、乙醇、乳酸等采用SHIMADZU 10A型高效液相色谱 (岛津制作所生产) 测定.色谱柱为Aminex HPX-87H柱, 柱温65 3 结果与分析 3.1 外源引发温度对甘油脱水酶活性的影响 利用外源添加的方式研究了ATP驱动对实验菌株K.penumoniae L1代谢过程的影响.外源能量对菌体生长的影响情况见图1, 图中Control为没有外源添加ATP的空白对照 (下同) .由图可见, 与对照相比, 添加外源能量物质在一定程度上抑制菌体的增长, 这可能与长期的生物进化过程有关.作为酶的天然载体和生存环境, 微生物细胞都是以最经济和有利于自身的方式来对碳源和能源进行分配, 通过调控各种酶的活性和表达量来合成所需的各种物质, 并为细胞提供能量.在外加能源的情况下, 菌体可以直接利用外源能量进行代谢, 这在一定程度上削弱了菌体生长产能的驱动力.另外, ATP的加入也可能在一定程度上提高了甘油脱水酶的酶活, 使甘油还原代谢途径得到加强, 中间产物3-HPA积累, 对细胞产生毒害作用. 3.2 外源atp对k.pneumoniae合成1,3-pd的影响 图2 (a) 是在培养基中添加0.1～0.8 g/L ATP时K.pneumoniae L1合成1, 3-PD的情况.可见, 外源ATP可不同程度促进1, 3-PD的合成, 而且越到发酵后期, 促进作用越明显.经过72 h厌氧培养, 外源添加0.6及0.8 g/L ATP可使1, 3-PD浓度分别达到10.2和9.4 g/L, 比对照提高了50%～70%. 另外还考察了单位菌体合成1, 3-PD的情况, 结果见图2 (b) .在实验范围内, 虽然外源ATP对菌体生长有一定的抑制, 但单位菌体合成1, 3-PD的能力提高了1倍左右, 表明ATP对于菌体合成1, 3-PD有非常重要的作用.在生物法合成1, 3-PD的原始工艺中, 菌体本身合成的ATP量较低, 限制了甘油的还原代谢.因此, 要提高1, 3-PD合成能力, 提高ATP的供给量是一个可行的思路. 外源添加ATP对于K.pneumoniae L1发酵甘油合成1, 3-PD得率的影响见图3, 表明在发酵前期 (0～24 h) , 各实验条件下1, 3-PD得率差别不大, 平均30% (ω) 左右;24 h之后 (图中虚线处) , 对照样及添加较低浓度的ATP (≤0.4 g/L) 时1, 3-PD得率迅速下降, 而添加0.6～0.8 g/L ATP则能使1, 3-PD得率维持在30%以上, 发酵全过程的1, 3-PD得率也相应地由13%提高到30%以上. 3.3 atp对甘油脱水酶活性的影响 前面的实验结果表明, 一定浓度的ATP促进了K.pneumoniae合成1, 3-PD, 单位菌体合成1, 3-PD的量大大增加.这可能有两种作用机制:一是ATP促使单位细胞表达的甘油脱水酶