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克氏原螯虾卵黄蛋白的分离与鉴定 卵石是生殖时期一些动物产生的蛋白质，是卵石的主要成分。对于甲壳动物来说，卵石是它们生长发育所必需的养分。现在，人们对虾和明虾的几种类型进行了研究。例如，中国明虾。 1 材料和方法 1.1 卵巢的解剖 克氏原螯虾在7月份购于保定市府河市场, 成熟个体卵巢呈紫黑色, 未成熟的卵巢呈白色.将2种发育程度不同的卵巢解剖出并于-20 ℃冰箱中保存. 1.2 1.2.1 离心液的制备 取卵巢0.5 g, 加入5 mL Tris_HCl缓冲液 (0.5 mol/L, pH 7.0) 于玻璃匀浆器中匀浆, 然后用高速冷冻离心机10 000 r/min离心30 min, 弃去上层脂肪后取上清液备用. 1.2.2 黄蛋白部分的生化性质测定 1.2.2. 不同乙醇中有效组的聚苯胺染色 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (分离胶质量浓度为60 g/L, 浓缩胶质量浓度为40 g/L) 结束后, 用体积分数为60%的乙醇饱和苏丹黑溶液进行染色, 50%乙醇中脱色. 1.2.2. 异丙醇固定剂固定 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (分离胶质量浓度为60 g/L, 浓缩胶质量浓度为40 g/L) 结束后, 胶放入固定液 (体积分数为25%的异丙醇, 10%的醋酸, 65%的水) 中进行固定, 1 h后更新1次;之后将胶放入含有0.5 mol/L CaCl 1.2.2. 染色织物的制备 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 (分离胶质量浓度为60 g/L, 浓缩胶质量浓度为40 g/L) 结束后, 将胶放入质量浓度为10 g/L的高碘酸中固定10 min, 双蒸水冲洗, 之后入Schiff试剂中染色15 min, 用漂洗液 (质量浓度为100 g/L的偏重亚硫酸钠5 mL, 1 mol/L HCl 5 mL, 水100 mL) 冲洗3次, 流水冲洗10 min, 颜色呈深红色后在水中脱色. 1.2.2. 4-对胡萝卜特定氨基酸的检测 用HITACHI U 2000紫外可见分光光度计对提纯后的卵黄蛋白及卵黄蛋白原溶液进行连续光谱扫描 (700～200 nm) . 1.2.2. 卵黄蛋白的分子质量检测 采用50～150 g/L的梯度电泳测二者的总分子质量, 浓缩胶质量浓度为40 g/L, 电泳完毕后考玛斯亮蓝R 250染色, 测量标准蛋白以及卵黄蛋白和卵黄蛋白原的迁移距离, 以标准蛋白分子质量的对数为纵坐标, 各蛋白的迁移率为横坐标作图, 求出标准曲线, 并按照曲线求出二者的总分子质量.在电泳时加入标准蛋白:各种蛋白的分子质量分别为Thyroglobulin (669 ku) , Ferritin (440 ku) , Catalase (232 ku) , Lactate Dehydrogenase (140 ku) , Albumin (67 ku) . 1.2.2. sdstable测定卵黄蛋白和卵黄蛋白亚基数目和分子质量 采用75 g/L分离胶, 50 g/L浓缩胶的SDS_PAGE测定卵黄蛋白和卵黄蛋白原的亚基数目和分子质量.同时加入标准蛋白:Myosin (220 ku) , α 1.2.2. 电泳比较sds东南角亚基数目 采用SDS_PAGE (分离胶75 g/L) , 用含有巯基乙醇的SDS_PAGE样品缓冲液和不含有巯基乙醇的SDS_PAGE样品缓冲液对样品处理后进行电泳并比较二者的亚基数目. 2 结果 2.1 卵黄蛋白带的特点 苏丹黑染色后, 卵黄蛋白带呈黑色.这说明其为脂蛋白 (图1 a) . 2.2 去磷蛋白的检测 经染色后, 卵黄蛋白带呈蓝色.这表明卵黄蛋白是一种磷蛋白 (图1 b) . 2.3 卵黄蛋白带红色 经Schiff 试剂染色后, 卵黄蛋白带呈红色.说明其为一种糖蛋白 (图1 c) . 2.4 黄蛋白溶液的光催化氧化 在进行连续光谱扫描后, 卵黄蛋白溶液在480 nm附近有光吸收峰.这表明其具有类胡萝卜素辅基 (图2) . 2.5 到克氏原螯虾卵黄蛋白的分子质量 经梯度电泳得到克氏原螯虾卵黄蛋白的分子质量为481 2.6 “三自”结构的应用 经 2.7 加入基乙醇卵黄蛋白经 样品缓冲液中加入巯基乙醇卵黄蛋白经 3 天然克氏原螯虾卵黄蛋白的组成成分 从实验结果可以看出, 克氏原螯虾的卵黄蛋白的组成比较复杂, 含有糖、脂、磷、类胡萝卜素等多种辅基.这和对其他甲壳动物卵黄蛋白的研究结果基本相同.由于卵黄蛋白是一种营养物质, 对于胚胎及幼体的发育至关重要.其组成成分的复杂性是和其功能相一致的.而且, 在天然 克氏原螯虾卵黄蛋白的总分子质量是481 目前, 人们还对甲壳动物一些种类的卵黄蛋白原 (