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克氏原螯虾pccyc基因克隆与功能验证 循环蛋白基因（cyc基因）是明末清初生物基因的重要基因之一。生物钟是机体内部周期性接近24 h自我维持的时钟。这个时钟由分子振荡器组成,分子振荡器由转录激活因子和时钟本身及其他基因的抑制剂组成,分别形成正负循环 克氏原螯虾( 1 材料和方法 1.1 模拟克氏原螯虾的生长 试验用克氏原螯虾样品于徐州(云龙区周边水域)野外捕捉采集,为除去性别的干扰,在进行试验时全部选取体长9～11 cm的雄性个体。活体样本采集完毕后,需要进行光照驯化。在实验室循环水箱中饲养15 d,温度恒定25 ℃,24 h充氧,箱底铺满沙石,并放置尼龙管和石块,模拟克氏原螯虾自然生境躲避模式。用全光谱日光灯模拟室外光照,光暗比12L∶12D(12LD)。驯化15 d之后将样品分成3组:第1组是驯化15 d之后的样品直接用于试验;第2组从中选取健康的雄性个体54只转入24 h持续黑暗中0L∶24D(24DD);第3组选取健康的雄性个体54尾转入72 h的持续黑暗中0L∶72D(72DD)。不同光照条件下的克氏原螯虾均在同一水箱中培养。在不同的光照模式下分别培养结束后,于时间点7:00、11:00、15:00、19:00、23:00、翌日03:00、7:00进行取样。每个时间点每组取2尾,共取3个平行对照组。使用的试验操作程序经南京师范大学生物医学研究伦理委员会[SOXR(江苏)2015-028]批准。 试验所用引物名称及序列见表1,引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。 1.2 方法 1.2.1 rna的质量和纯度 将克氏原螯虾的肝胰腺、脑、眼柄组织按照Trizol试剂说明书提取总RNA,用Thermo NanoDrop 2000/2000C(Thermo Fisher Scientific,USA)分光光度计和1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和纯度,使用反转录试剂盒PrimeScript 1.2.2 pccyc基因发现序列的克隆和确定序列 根据从克氏原螯虾转录组中(Accession code: SRP044128) 1.2.3 合成cdna的程序 选取已验证的EST序列,用Primer Premier 5.0软件设计3′RACE和5′RACE的特异性引物和巢式PCR反应的特异性引物。先对5′RACE PCR进行前处理再进行反转录。对提取的总RNA进行CIAP、TAP处理,与5′RACE Adaptor连接后反转录合成cDNA。之后进行巢式PCR反应。同样对3′RACE PCR进行前处理,合成cDNA时要设立M-MLV(-)对照。反应体系:Total RNA(1 μg/μL) 1 μL,3′RACE Adaptor(5 μmol/L) 1 μL,dNTP Mixture(10 mmol/L each) 1 μL,RNase Free deionized H 1.2.4 pcr扩增及电泳检测 为验证RACE PCR扩增的序列是否正确,以EST序列验证时的cDNA为模板,使用高保真酶,Cycle-QCF/Cycle-QCR 为引物,进行PCR 扩增。反应体系及条件同 EST 序列验证。反应结束后,取PCR产物于1%的琼脂糖凝胶上电泳检测。根据检测结果确定使用 PCR 产物直接纯化还是凝胶回收[使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 (TaKaRa,大连)切胶回收 PCR 产物],用 Cycle-QCF/Cycle-QCR 对 PCR 产物进行测序。 1.2.5 蛋白质框架、疏水性和结构预测 利用美国国立生物技术信息中心(/BLAST) Blast验证PcCyc基因的cDNA全长。用ORF Finder查找PcCyc基因的开放阅读框。在线服务器ExPASy的ProtParam工具分析PcCYC蛋白相关的理化性质。在线软件Motif Scan可以用来搜索PcCYC蛋白的motif。分别用在线服务器ExPASy的ProtScale工具和在线软件SignalP分析PcCYC蛋白的疏水性和预测分析信号肽。TMHMM Server v.2.0预测分析PcCYC蛋白跨膜区。在线软件PSORT Ⅱ Prediction预测分析PcCYC蛋白结构域。PcCYC蛋白二级结构预测使用PSIPRED。三级结构预测分析使用在线服务器Zhang Lab。 1.2.6 不同日夜节奏表的表达 克氏原螯虾不同光照的样本用Trizol法进行总RNA提取;并各取500 ng用反转录试剂盒PrimeScript 2 结果 2.1 生物酶抑制剂yc基因开放阅读框序列的扩增验证 5′RACE PCR和3′RACE PCR产物经测序分别得到312 bp的5′端序列,1185 bp和1