6种不同极性溶剂提取物对6种常见菌的抑菌性筛选.docxVIP

6种不同极性溶剂提取物对6种常见菌的抑菌性筛选 裸花紫珍珠etarn是马鞭草科的一种植物。在中国，它主要分布在广东、广东和海南。药品的位置是地上的干燥部分。它是海南的大面积隧道医疗材料之一。裸花紫珠全年均可采收, 除去杂质, 晒干, 枝叶有抗菌止血、消炎解毒、祛风祛湿之功效 1 细菌培养算法 裸花紫珠, 海南九芝堂药厂提供;白色念珠菌;铜绿假单胞菌;大肠杆菌;金黄色葡萄球菌, 肺炎双球菌, 枯草芽孢杆菌;临床分离菌株, 海南省人民医院检验科惠赠, 经实验室传代保藏多次后的菌株。 2 方法和结果 2.1 菌株的活化培养 准确称取生物样品冻干品9 g, 装入34 ml萃取池中, 萃取池底部提前加装纤维素滤片, 依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、水为提取溶剂, 设定ASE提取参数 (提取压力为10 MPa, 提取温度为45℃, 提取时间12min, 循环2次) 白色念珠菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、铜绿假单胞菌分别接种于NB培养基中 (18 g NB粉末溶于1 L蒸馏水中, 分装三角瓶, 121℃高压灭菌15 min) , 37℃活化培养1次 (第2次的时候, 培养一批菌) 每次活化培养时间为16 h。然后接入至无菌NB培养基中, 150r·min 对6种菌分别吸取一定浓度的提取药液100μl至放好的的牛津杯中, 注意不要将药液溢出牛津杯外, 同时吸取相同体积的DMSO和头孢他啶加入准备好的牛津杯中。 指示菌在最适生长温度37℃的恒温培养箱中培养24h, 记录抑菌圈值。 2.1.7 反应物的抑菌效果 从表3的结果可以看出, 不同的提取药液有不同的抑菌效果, 但水提药液几乎看不到抑菌圈, 其他5种提取药液对不同的菌分别有不同的抑菌效果。除了水提物, 其他5种溶剂提取药液对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌都有比较好的抑菌效果, 其他4种菌在某一种到两种溶剂提取液中有较好的抑菌效果, 乙酸乙酯提取液对多数菌种有中强度的抑菌效果。头孢对每一种菌都有非常好的抑菌圈值, DMSO没有抑菌性或者说抑菌性很弱。 2.2 ase联合有机溶剂提取法 活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青 (蓝色) 转化为荧光物质试卤灵 (粉红色) , 试卤灵继续被细胞还原为无荧光的白色物质 (白色) , 无活性或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青 准确称取50mg的刃天青试剂, 使用无菌水溶解, 定容到50ml的的容量瓶里, 配制成1 mg/ml溶液, 5°C避光保存备用。 准确称取裸花紫珠粉末10 g, 装入34 ml萃取池中, 萃取池底部提前加装纤维素滤片, 依次以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇为提取溶剂, 设定ASE提取参数 (提取压力为10 MPa, 提取温度为45℃, 提取时间12min, 循环2次) , 有机溶剂提取液常温干燥, 分别制得裸花紫珠不同的生物活性物质。称取相同质量0.2g活性物质用2ml二甲基亚砜 (DMSO) 溶解成0.1g/ml, 待用。 使用纯的DMSO完全溶解后, 用一定浓度的DMSO进行对半稀释8个浓度。头孢同样使用无菌水配制成50mg/10m L溶液后。由于在做刃天青实验时发现DMSO在一定浓度下有抑菌作用, 且对大肠杆菌作用较弱, 所以, 需做预实验消除DMSO对本实验的影响。预实验通过增加大肠杆菌菌悬液的体积来稀释DMSO的浓度, 达到确定加菌悬液和药液的量的目的。 从表4可以看出DMSO在11%以下显示对大肠杆菌没有抑菌性, 所以在实验时必须把其调到更低才可以不影响实验。所以, 又考虑到直接用提取溶剂做空白对照, 再进行溶剂测试预实验。 2.2.4. 加溶剂对实验的影响 从表5可以看出只有乙醇和石油醚可能在加菌量至少为175μl以上及加溶剂为20μl时才不会影响实验, 此时溶剂体积浓度为10.2%。综上, DMSO浓度要求稍弱些, 所以, 在96孔板中按照表6加样。 2.2.5 悬浮液的制备 每组实验重复3次, 加样后, 用封口膜将96孔板密封并置于37°C自动新型恒温培养箱中培养16h, 每小时观察1次颜色变化并记录。 2.2.7 不同提取药剂抑菌效果检测 从图1可以看出第1排为, 只加了菌和DMSO的阴性对照, 全显示红色 (黑白图呈浅灰色) , 表明DMSO对实验菌没有抑菌效果或者效果很弱, 第2排为头孢的阳性对照组, 全显蓝色 (黑白图呈深色) , 说明头孢有很好的抑菌效果, 3~7为5种提取药液对大肠杆菌的显色结果, 可以看出乙醇和正丁醇都有较低的抑菌显色结果, 乙酸乙酯和氯仿段没有, 石油醚段也有最低抑菌浓度, 但比乙醇和正丁醇浓度高。8~12为5种提取药液对枯草芽孢杆菌显色结果, 可以看出乙醇和正丁醇也都有较低的抑菌显色结果, 乙酸乙酯段抑菌效果较弱, 氯仿段提取液几乎