倍半稀释法测定10-hda对金黄色葡萄球菌的抑菌效果.docxVIP

倍半稀释法测定10-hda对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 10-羟色胺-2-戈齐酸（10-hydro-2-acid），简称10-hda。这是人体中的重要脂肪酸。约50%的天然脂肪体在天然浆中含量约为1.4%2.0%。 关于抗菌物质的抑菌机理报道很多, 一般认为抑菌剂的主要作用途径是膜攻击、抑制细胞呼吸或者抑制蛋白质的合成等 1 材料和方法 1.1 其他试剂的制备 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus) 为本实验室保藏菌种, 其他试剂均为分析纯。 DDS-11A电导率仪, 上海第二分析仪器厂;紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器有限公司;DYY-12电泳仪, 北京市六一仪器厂;Champ Gel5500凝胶成像系统, 北京赛智创业科技有限公司;原子力显微镜, 德国Bruker公司。 1.2 测试方法 1.2.1 菌种培养及培养 配制LB液体培养基经121℃灭菌20 min后, 冷却, 接种金黄色葡萄球菌后于37℃、180 r/min条件下培养24 h。取菌液进行平板划线培养, 挑取生长状况较好的单个菌落进行液体培养基扩培。 1.2.2 lfoxide,dmso 液体倍半稀释法:用二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, 即DMSO) 配制10-HDA倍比稀释液, 同时设置无菌水对照组和溶剂对照组 (即DMSO对照组) 。取对数生长期的金黄色葡萄球菌培养液稀释至1×10 1.2.3 -hda的体外生长 取活化后的金黄色葡萄球菌菌种按1% (v/v) 接种量分别接种于4个100 m L LB培养基中, 分别加入等体积的不同浓度的10-HDA, 使其终浓度分别为0×MIC (即DMSO对照组) 、1×MIC、3×MIC, 同时设置无菌水空白对照组, 于37℃、180 r/min培养, 不同时间点取样测OD 1.2.4 菌株4的离心测定 将培养至对数生长期的金黄色葡萄球菌于5 000 r/min离心10 min, 收集菌体。然后用灭菌生理盐水洗涤, 重复操作两次, 然后用生理盐水调节菌体浓度至10 1.2.5 影响细菌物质含碳量的体积 在浓度为10 1.2.6 影响细胞的微结构特征的影响 取制备的浓度为10 1.2.7 影响细菌代谢活力的因素 取制备的浓度为10 1.2.8 添加dmso后体外生长曲线 金黄色葡萄球菌培养至对数生长期, 按5% (v/v) 接种量分别接种于50 m L LB液体培养基中, 分为对照组和试验组, 试验组加入10-HDA溶液分别使其终浓度为1×MIC、3×MIC, 同时设置对照组, 加入等体积的DMSO溶剂, 继续于37℃、150 r/min培养, 分别于8 h后取样, 稀释成相同的吸光度值后取样10 m L于5 000 r/min离心10 min。然后用生理盐水洗涤2次, 取沉淀加20μL无菌水和20μL上样缓冲液于100℃保温5 min, 再次离心, 取10μL上清液进行SDS凝胶电泳。 2 结果与分析 2.1 mic测试结果 由表1结果可知, 10-HDA对金黄色葡萄球菌的抑制效果明显, 最小抑制质量浓度为0.062mg/m L。 2.2 对细菌生长曲线的影响 菌液的光密度值 (OD值) 可以用来衡量菌液中细菌数目的多少, 因此, OD值的变化可以间接的反应10-HDA对金黄色葡萄球菌生长的影响情况。10-HDA对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图1。由图1结果可知, 无菌水对照组和0×MIC试验组 (即DMSO对照组) 的菌体生长状态几乎无差别, 因此可以忽略10-HDA的溶剂 (DMSO) 对金黄色葡萄球菌的生长的影响。加入10-HDA的试验组与对照组相比, 菌液的光密度值明显降低, 表明10-HDA对金黄色葡萄球菌的生长有较好的抑制作用, 且随着加入的10-HDA浓度由1×MIC增加到3×MIC, OD 2.3 对菌体膜渗透率的影响 在正常情况下, 细菌的细胞膜具有一定的半透性及流动性。当细菌不利生长条件或者抑菌剂作用时, 细菌细胞膜会遭到破坏, 丧失其半透性并流动性降低, 进而菌体的保护屏障被打破, 内部的电解质 (如K 图2反映了金黄色葡萄球菌经10-HDA处理后其菌液电导率的变化情况。由图2可知, 无菌水对照组和0×MIC试验组 (即为溶剂对照组) 的菌液电导率变化不大, 因此可以忽略溶剂二甲基亚砜对金黄色葡萄球菌的细胞膜渗透性的影响。而当菌液在1×MIC浓度的10-HDA处理后, 菌液的电导率明显高于对照组, 这说明了在1×MIC浓度的10-HDA使细胞膜遭到破坏, 导致细菌细胞膜流动性降低, 通透性增大, 从而大量电解质外渗。随着作用时间的延续, 菌液的电导率也相应增加, 菌体电解质的外泄程度进一步提高, 说明菌体细胞内环境和细胞膜稳定性已受到破坏, 金