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从高碳醇萃取林可霉素的研究 林可霉素是林可链霉菌变异引起的抗生素。它对大多数常见的革兰氏阳性菌都有抗菌活性，并且抗药性发展缓慢。对呼吸、骨骼和软组织的感染也有良好疗效。林可霉素A的结构式如图1所示。除林可霉素A外,林可霉素产生菌在一定条件下还产生B、C、D等类似物(表1),除了林可霉素C的抗菌活性与林可霉素A相同外,其余都较差,没有实用价值。 国内林可霉素生产厂家发酵产物以林可霉素A为主,同时也含有约10%的林可霉素B。林可霉素B抗菌活力较小,在产品中含量应控制在较低水平。随着林可霉素更多地被作为半合成抗生素的原料来使用,对于降低其中林可霉素B含量的要求也在提高。从发酵液中提取林可霉素,国内多采用丁醇提取工艺,萃取时对林可霉素B几乎没有分离作用,产品中林可霉素B含量较高。 为了提高提取收率和产品纯度,一 直在进行更有效的新提取工艺的研究工作。高碳醇对林可霉素A有较高选择性,以高碳醇为萃取剂,有利于降低产品中林可霉素B含量;高碳醇的水不溶性和高沸点,有利于减少溶剂损失。本文以降低产品中林可霉素B含量为目的,研究了以混合高碳醇为溶剂的提取工艺路线,重点考察了工艺中关键性问题。在此基础上,还验证了保留原丁醇提取工艺,利用混合高碳醇萃取对林可霉素产品进行纯化的可行性。 1 材料和方法 1.1 林可霉素盐酸盐标准品 发酵滤液由抗生素生产厂家提供,是放罐后发酵液经酸化后过滤所得清液,化学方法定效价其中含有10%的林可霉素B。林可霉素盐酸盐标准品由上海市药品检定所提供。 实验中所用的林可霉素丁醇提取一次结晶、二次结晶分别为林可霉素生产厂家丁醇提取工艺的中间产品和成品,其中林可霉素B的含量分别为5.2%和4.2%。 1.2 样品含量测定 萃取、碱洗、反萃实验在带恒温夹套的分液漏斗中进行,恒温25℃下操作,振荡10min以确保达到平衡。根据所需的操作级数,采用多只分液漏斗串联,模拟进行多级逆流实验,直到操作达到稳定为止。 反萃液在旋转蒸发器中进行减压浓缩,温度50～60℃,真空度为5.33～6.67×104Pa。林可霉素结晶在真空干燥器中50℃下烘干。 林可霉素和氯化钯在酸性条件下反应生成有色络合物,在380nm处有明显吸收峰,利用此性质采用分光光度法分析林可霉素含量(包括A和B组分)。测定发酵液效价时,调节发酵液pH11～12,再用正丁醇萃取,取丁醇提取液,用95%乙醇稀释至适当浓度后显色分析。分析有机相中林可霉素含量时,用95%乙醇稀释至适当浓度后进行显色。以林可霉素盐酸盐标准品作标准曲线,样品分析结果以林可霉素A盐酸盐的形式来表示。 产品中林可霉素B的含量采用HPLC分析,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;0.05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸调pH值至6.0)∶甲醇(4:6)为流动相;检测波长214nm。 2 结果与讨论 2.1 高碳醇萃取剂最佳条件 以高碳醇为萃取剂从发酵液中提取林可霉素时,由于萃取剂的改变,原先以丁醇为萃取剂提取工艺的条件要发生较大变化:(1)以高碳醇为萃取剂时容易发生乳化,需采取发酵滤液絮凝处理、调节混合醇组成等措施,以解决乳化问题;(2)高碳醇对林可霉素的萃取能力显著小于丁醇,为保证较高的提取效率,萃取级数、相比等有较大改变,洗涤和反萃取等操作条件也有相应变化(图2)。 2.1.1 甲壳素和硫酸铝钾的用量对产酶环境质量的影响 发酵滤液在放罐后已经进行了草酸酸化处理,去除大量的蛋白质等杂质。由于在偏碱性条件下,高碳醇萃取时易发生乳化现象;为了减少高碳醇萃取时的乳化,萃取实验前还需对发酵滤液进行絮凝处理,再去除部分蛋白质等表面活性剂杂质。 调节发酵滤液pH至10.0,加入甲壳素溶液、硫酸铝钾[KAl(SO4)2·12H2O](用量分别为发酵液的1%和0.2%),用NaOH溶液调pH至9.0,絮凝3h;最后再加入NaOH溶液,调pH至10.0,过滤除去絮凝沉淀。絮凝过程中效价回收率为98.9%。 甲壳素和硫酸铝钾起絮凝剂作用,使发酵液中剩余的部分蛋白质沉淀析出,有利于改善萃取后的分相情况,减少乳化损失。实验中,减少甲壳素溶液(0.1%～0.5%)和硫酸铝钾(0.05%～0.1%)的用量,析出絮凝沉淀显著减少;增加甲壳素(1.5%～2%)、硫酸铝钾的用量(0.3%～0.4%),过滤所得的絮凝沉淀量没有进一步增加;因此,下文的萃取实验中,发酵滤液按照甲壳素溶液、硫酸铝钾加入量分别为发酵液的1%和0.2%,进行絮凝处理。 2.1.2 林可可霉素的提取 (1) 萃取有机相的制备 表1所示为不同组成的萃取剂对林可霉素萃取实验结果。水相为二次结晶林可霉素溶液,浓度4000μg/ml,pH=10,有机相由正辛醇(C8)和正癸醇(C10)以不同配比混合而成,25℃下萃取,相比VO/VA=1/3。 尽管增加辛醇含量可略微增加有机相的萃