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一种电转法转化枯草芽孢杆菌的方法 本生物科学是一个重要的工业微生物。对其遗传和生理特征的研究由来已久。coli对其遗传背景和生理特征的研究是coli的标准。枯草芽孢杆菌能直接将目的基因产物分泌到培养基中, 且表达产物可溶、可正确折叠, 具有生物活性, 同时表达产物与胞内蛋白分离, 无需破碎细胞, 利于分离纯化, 是极具应用前景的基因表达宿主。 但是, 在枯草芽孢杆菌工程菌构建过程中, 能自发形成感受态的菌株极少, 且感受态持续时间短暂, 分子克隆效率低, 从而限制了外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效表达。目前外源基因导入宿主菌的主要手段有感受态法、原生质体转化法和电击转化法。其中, 电击转化法被认为是转化效率最高的一种方法。然而, 电击转化过程中需要平衡转化效率和死亡率的关系, 随着电场强度的增加, 外源DNA进入宿主细胞的可能性越大, 死亡率也随之增加。陆雁等以不同预培养时间优化复制子转化至枯草芽孢杆菌WB600中, 最高转化率为2.58×104cfu/μg;王培培等对枯草芽孢杆菌NCD电转化条件进行优化, 最高效率为6.07×104cfu/μg;而目前芽孢杆菌电击转化的转化效率最高为1.4×106cfu/μg, 还不能满足高效率转化, 如构建基因文库的要求。本实验通过对枯草芽孢杆菌制备感受态时生长状态、穿梭载体加入量、回复培养基、电击转化缓冲液以及电击时电压的选择等方面条件的优化, 使枯草芽孢杆菌的转化率增大, 为后续实验奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 phy-p治疗 枯草芽孢杆菌WB600、大肠杆菌JM109、穿梭载体p HY-p43均由江南大学生物工程学院余晓斌教授 (实验室) 惠赠;分子生物学试剂及试剂盒均购买于生工生物 (上海) 股份有限公司, 其他试剂均为国产分析纯。 1.1.2 氯化钠nacl、琼脂粉质量浓度 LB液体培养基的制备方法:胰蛋白胨质量浓度为10 g/L, 酵母提取物质量浓度为5 g/L, 氯化钠质量浓度为10 g/L, p H值为7.2。 LB固体培养基的制备方法:胰蛋白胨质量浓度为10 g/L, 酵母提取物质量浓度为5 g/L, 氯化钠 (Na Cl) 质量浓度为10 g/L, 琼脂粉质量浓度为1.5 g/L, p H值为7.2。 SLB培养基的制备方法:蛋白胨质量浓度为10 g/L, 酵母粉质量浓度为5 g/L, Na Cl质量浓度为10 g/L, 山梨醇的浓度为0.5mol/L, p H值为7.2。 ORM培养基的制备方法:蛋白胨质量浓度为10 g/L, 酵母粉质量浓度为5 g/L, Na Cl质量浓度为10 g/L, 山梨醇的浓度为0.8 mol/L, p H值为7.2。 RM培养基的制备方法:蛋白胨质量浓度为10 g/L, 酵母粉质量浓度为5 g/L, Na Cl质量浓度为10 g/L, 山梨醇的浓度为0.5 mol/L, p H值为7.2。 1.1.3 山梨醇、甘露醇的制备 氨苄青霉素:储存浓度为50 mg/m L, 工作浓度为50μg/m L; 四环素:储存浓度为5 mg/m L, 工作浓度为50μg/m L; SMG缓冲液:0.5 mol/L山梨醇, 0.5 mol/L甘露醇, 10 g/L甘油。使用去离子水配制, 121℃灭菌20 min; SG缓冲液:0.5 mol/L山梨醇, 10 g/L甘油, 使用去离子水配制, 121℃灭菌20 min; MG缓冲液:0.5 mol/L甘露醇, 10 g/L甘油, 使用去离子水配制, 121℃灭菌20 min; Gly缓冲液:10 g/L甘油, 使用去离子水配制, 121℃灭菌20 min。 1.2 细胞培养和分离 从4℃冰箱中取出保藏的枯草芽孢杆菌WB600, 活化菌株;用移液枪吸取1 m L过夜培养物在无菌净化台接种于40 m L SLB培养基中, 37℃, 200 r/min振荡培养至OD600nm=0.7;将菌液冰水浴10 min后, 放入离心管中, 4℃, 5 000r/min离心5 min, 弃上清, 收集细胞;在无菌净化台上用0℃预冷的40 m L SMG缓冲液通过移液枪吹悬步收集的细胞, 4℃, 5 000 r/min离心5 min, 弃上清, 收集细胞, 漂洗4次;用2 m L SMG缓冲液吹悬收集的细胞, 分装于离心管 (60μL/管) 中, -80℃保存, 每管约有6×108个感受态细胞。 1.3 质粒琼脂糖凝胶电泳的制备 取50 ng p HY-P43质粒DNA, 加入到1管感受态细胞中, 在冰上通过移液枪轻微吐吸使p HY-P43质粒DNA和感受态细胞充分混匀, 冰浴2min;将体系转移至0℃预冷的电击杯 (1 mm) 中, 用电转仪进行电击 (电压21 k V/cm, 电容25μF, 电