SN_T 3558-2013马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3558—2013马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of Marburg virus2013-03-01发布2013-09-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局查真伪 SN/T 3558—2013前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。本标准主要起草人：洪烨、师永霞、袁志明、郑夔、相大鹏、黄、李小波、黄吉城、幸芦琴、郭波旋钟玉清、李燕。1 SN/T 3558--2013马尔堡病毒 RT-PCR 和实时荧光RT-PCR 检测方法1 范围本标准规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理，马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员携带高尔堡病事的分子生物学检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。比注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489实验室　生物安全通用要求人间传染的病原微生物名录（卫生部）3缩略语下列缩略语适用于本文件。RT-PCR:反转录-聚合酶链反应实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应Ct值：每个反应管内的荧光信号还到设庭的阈值时所经历的循环数RNA:核糖核酸FAM:FAM荧光染料，一种荧龙报告团4　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。4. 1马尔堡出血热Marburg hemorrhagic fever;MHF由马尔堡病毒（Marburg Virus)引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密切接触传播，传染性强，病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为青猴病和非洲出血热。4.2马尔堡病毒‧Marburg virus属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链 RNA，长约 19 kb，编码 7种病毒蛋白，包括 N蛋白（NP）、病毒蛋白35（VP35）、病毒蛋白30（VP30）、病毒蛋白24（VP24）、糖蛋白4（gp4）、RNA依赖的RNA聚合酶主要成分糖蛋白7（gp7)和次要成分病毒蛋白40(VP40）。5生物安全要求按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，马尔堡病毒相关材料的生物安全要求1 SN/T 3558—2013如下：马尔堡病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全IV级（BSL-4或ABSI.4)实验室内进行；马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级(BSI-3)实验室内进行；马尔堡病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全I级（BSI-2)实验室内进行；-马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。6人体血清标本的采集、运输和保存无菌采集疑似病例发病3天内静脉血 3mL～5mL，室温静置30min使其凝固，500g离心10 min.收集血清于2ml无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。7 血清标本的处理血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在一70℃冰箱。8马尔堡病毒的 RT-PCR 检测8.1主要仪器本方法使用的主要仪器如下：-PCR扩增仪；千分之一天平;超净工作台；ⅡI级生物安全柜；高压灭菌锅；低温高速离心机：最大离心力20000g;电泳仪；凝胶成像分析系统；一旋涡振荡器；-冰箱:4℃、一20℃和一70℃;移液器:10 μL、20 μl、100 μI、200 μL 和 1 mL;恒温水浴锅。8.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下：核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViral RNAKit提取病毒核酸；-RT-PCR 试剂:美国 Qiagen 公司One step RT-PCR kit;无 RNA酶的DEPC水;1）由指定单位提供，给出这-信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2 SN/T 3558—2013-RT-PCR检测的引物：上游引物 MBGV-FP（5’-CGATGGGCTTTCAGGACAGG-3）和下游引物MBGV-RP(5’-CACGAGGGTTTTGACCTTGAAT-3）,预期扩增片段为 190 bp;电泳缓冲液（50×TAE）：称取242gTris碱，溶于700