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鲜壁虎活性组分对人肝癌bel-7504细胞增殖及凋亡的影响 肝癌是大多数肿瘤之一。治疗肝癌主要以手术和化疗为主，但目前传统的临床治疗方法和预后并不理想。因此，有必要在癌症住院后寻求新的治疗方法。传统中药的抗肿瘤作用具有多靶点、多环节、多效应的特点,能作用于肿瘤发生、发展的多个环节,同时还具有毒副反应小、提高机体免疫力、不易产生耐药性等特点,因此成为抗肿瘤药物研究的热点。壁虎是我国治疗肿瘤的传统中药药材,在《本草纲目》中已有记载。药用壁虎是壁虎科动物无蹼壁虎、多痣壁虎或其他几种壁虎除去内脏的全体,其药性咸寒软坚,具有祛风、定惊、散结、解毒的功效。研究表明壁虎具有抗肿瘤作用。临床上,壁虎的复方制剂在治疗消化道肿瘤方面有较好的疗效。我国壁虎属已知有8种,包括无蹼壁虎、多痣壁虎、蹼趾壁虎、纵斑晰虎等。近年来研究较多的是产于北方地区的无蹼壁虎,本研究采用主要分布于广西的纵斑晰虎,实验探讨其活性组分在体外对人肝癌BEL-7404细胞增殖和凋亡的作用,为今后体内实验与临床应用提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 血清、试剂和酶联免疫药物 鲜壁虎为栖息于广西崇左市扶绥县岜盆乡墙缝、屋檐、树洞、石隙等处的纵斑晰虎;人肝癌细胞株BEL-7404由广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部提供;RPMI-1640和胎牛血清购自美国Hyclone公司;四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;Annexin V/PI双染试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司;酶联免疫检测仪为芬兰雷勃集团产品;EPICS XL流式细胞仪为美国贝克曼库尔特公司产品。 1.2 实验方法 1.2.1 冻干粉的制备 将活体壁虎冷冻处死后用清水洗净,粉碎匀浆冻溶10次,自然沉淀取上清液,以10 000 r/min低温离心20 min,取上清液,用冷干机抽干上清液即为冻干粉,存于-20℃备用。 1.2.2 干法浓度的确定 用RPMI-1640溶解鲜壁虎活性组分的冻干粉,其浓度以单位体积的溶液中含有原材料的量来确定。配制的鲜壁虎活性组分溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后存于-20℃备用。 1.2.3 培养条件:聚合物g/ml激素 人肝癌BEL-7404细胞在含有10%灭活胎牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640中置于37℃、5%的CO2孵箱中培养。每3～4 d传代1次,取对数生长期的细胞用于实验。 1.2.4 鲜壁虎活性成分的检测 取对数生长期的肝癌BEL-7404细胞,以8×103个细胞/孔的密度接种于96孔板,37℃、5%CO2培养8 h后弃去培养液,对照组仅用培养液处理,实验组加入不同质量浓度的鲜壁虎活性组分(320μg/ml,640μg/ml、1 280μg/ml、2 560μg/ml),以上浓度是参阅Song等研究并通过MTT预实验筛选出来的稳定的最适浓度。每个浓度设3个复孔。分别培养24 h、48 h、72 h后每孔加入MTT(5 mg/ml)20μl,继续培养4 h。终止培养,弃去上清液,每孔加入150μl DMSO,振荡2 min,使结晶物充分溶解,用酶联免疫检测仪(波长492 nm)测定各孔的OD值,计算细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。实验重复3次。 1.2.5 鲜壁虎活性组分的体外分离 取对数生长期的肝癌BEL-7404细胞,以每孔1 ml(30×104个细胞/ml)接种于6孔板中,每组设3个复孔,孵育8 h待细胞贴壁,以320μg/ml、640μg/ml、1 280μg/ml、2 560μg/ml鲜壁虎活性组分处理细胞48 h。经胰酶消化后收集细胞,以300×g离心5 min,PBS洗涤2次。按照细胞凋亡检测试剂盒的说明书进行操作,用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。 1.3 数据统计分析 采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,所有实验数据用均数±标准差表示。组间均数比较采用One-way ANOVA。P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 把握好药物对细胞增殖的抑制率 MTT法检测显示,鲜壁虎活性组分对肝癌BEL-7404细胞增殖的抑制作用呈时间和浓度依赖性,即随药物浓度的增加和作用时间的延长,其对细胞增殖的抑制作用逐渐增强。如以2 560μg/ml鲜壁虎活性组分作用BEL-7404细胞72 h后,对BEL-7404细胞增殖的抑制率达(40.87±1.59)%(P0.05)。见表1和图1。 2.2 鲜壁虎活性组分对bel-714细胞凋亡率的影响 以Annexin V-FITC标记凋亡细胞,PI标记死亡细胞。流式细胞仪分析结果显示,以320μg/ml、640μg/ml、1 280μg/ml、2 560μg/ml鲜壁虎活性组分作用于BEL-7404细胞