SN_T 4750-2017猪细环病毒检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4750--2017猪细环病毒检疫技术规范Quarantine protocol for swine torque teno sus virus2017-05-12 发布2017-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4750—2017前言本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国江西出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学院、江西省检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨春华、孙思扬、张强、陈庆富、周延、孙洁、祝建新、罗秋红、花群义。I SN/T 4750—2017猪细环病毒检疫技术规范1范围本标准规定了猪细环病毒 PCR检测法和实时荧光 PCR检测法的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪细环病毒核酸的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025动物检疫实验室生物安全操作规范3防污染措施本标准涉及的所有操作应符合GB19489，及SN/T 2025的有关规定。4缩略语下列缩略语适用于本文件。4.1 DEPC:焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)4.2DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)4.3 EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)4.4 PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)4.5 RNA:核糖核酸(ribonucleic acid)4.6 SDS:十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate)4.7TTSuV:猪细环病毒(Swine Torque Teno Sus Virus)(参见附录 A)5　设备、材料和试剂5.1设备、材料PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高压灭菌器、冰箱、微量可调移液器及吸头、冷冻离心机、1.5mL离心管。5.2试剂除特别说明外，本标准所用试剂均为分子生物学级，试验用水应符合GB/T6682的要求：样品裂解缓冲液（见B.4）、10%SDS、20g/L蛋白酶K、RNA酶、酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）、异丙醇、70%乙醇（用无水乙醇和DEPC水配制）、DEPC水、PCR反应预混液、PCR引物（见B.6）、电泳缓冲液、琼脂1. SN/T 4750—2017糖、DNA分子质量标准（DNA Marker）、胶红（或同等效果核酸染料）、实时荧光PCR反应预混液、引物和探针（见B.7）。6样品的采集、前处理和DNA模板制备6.1总则采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理应遵循GB19489实验室生物安全通用要求。6.2样品采集6.2.1血液样品用真空采血管采集样品，每管不少于5mI，编号备用。每个样品更换一支采血针头。编号后的血样经4℃静置30min，以4000 r/min，离心10 min，吸取血清（上清液)至1.5mL离心管内，编号备用。6.2.2组织样品取1g样品，经匀浆器研磨后，加人4mI.的样品裂解缓冲液（见B.4）悬浮，一20℃反复冻融3次，然后以5000 r/min,离心5min，取上清液备用。6.3样品贮运样品采集后，放人保温箱中，加冰，密封，送实验室。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存不应超过24h，若需长期保存，应放置20℃（或以下）冰箱，冻融不超过3次。6.4样品DNA模板制备6.4.1酚/三氯甲烷/异戊醇抽提法取处理好的血清、组织样品100μl于1.5mL离心管，加人样品裂解液缓冲液500uL，混匀，加人35 μL10%SDS和20g/L蛋白酶K 6μL，56℃水浴作用30 min。然后加人RNA酶30μg,37℃作用30 min，待样品冷却至室温，混匀，14 000 r/min，离心5 min；吸取上清液，加人等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）抽提，14000r/min，离心5min；吸取上层液体，加人等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)再抽提1次，14000r/min，离心5min；吸取上层液体，加人等体积的异丙醇，沉淀DNA，室温放置10min，14000r/min，离心5min;倒掉液体，加人lml.70%乙醇洗涤1次，晾干，取30μL灭菌水溶解DNA，贮存于一20℃备用或立即用于实时荧光PCR扩增。6.4.2商品化D