病毒TCID50测定_实用文档.docVIP

病毒TCID50测定（组织多半感染量） 操作步骤 准备细胞 拿出一块细胞培育板，每个孔大概传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10ml培育液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大概60％丰度即可接种病毒（下午传好板次日清晨就能用）。 细胞比较选用16个孔即可。滴定与比较能够在一块培育板长进行，操作中注意不要窜孔。也能够分别在不一样的细胞培育板长进行，但要保证明验条件一致。 稀释待测病毒液。 法为参照书上标准的操作方法 法参照书将液体量减少后的结果 病毒稀释液依据能否需要胰酶来选择合适的液体，不论哪一种都无血清。 A向每支试管中加入病毒稀释液。向1号试管中加入病毒，挨次 10倍系列 稀释至适合浓度，最后一支试管。 B 在 EP 管顶用无血清的孵育液 10 倍倍比稀释病毒原液 -1，10-2-10等)， (10 10 依据病毒大概的滴度确立稀释的倍数。初次滴定能够多稀释几个滴度。 依据接种的孔数稀释病毒，惯例每个稀释度接种4 孔，则每个稀释度配 μl，即 -1为50μl加入450μl的孵育液中；如每个稀释度接种8个孔，则各 500 10 配制1ml，即10-1为100μl加入900μl孵育液中。若接种8个孔，则相应增添液体量。上述的配液其实不是固定不变的，能够依据接种的量自行调整。 【！此步操作注意事项： 1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计剖析则还要增添至16个孔。 2）病毒稀释过程中必定将病毒液与孵育液充分混匀。 2）此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦抹加样器，并用紫外线照耀20min，保证无菌。使用新高压的tip头，外包装必定在超净台（或安全柜中翻开）。】 接种 取细胞培育板，用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培育液，汲取 孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次，而后吸出孵育液（此步目的是去除血清，由于血清能扰乱病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μl，根 据察看的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度（ 10-1，10-2） 到原液加样。【牢记：设置正常的细胞比较。每次实验要重复4次，计算标准差。】37℃CO2培育箱中孵育1h，拿出培育板吸去病毒液（从低浓度向高浓度汲取 可防止窜孔），加入保持液200μl持续在37℃CO2培育箱中培育。 培育 将培育板搁置于CO2培育箱。培育温度，培育天。 测定结果 拿出培育板，显微镜下察看细胞病变。计算方法 Spearman-Karber法 LgCCID50/=-（X0-d/2+d×∑/N1R1） X0=所有病变最低稀释度对数 d=稀释因数对数 N1=每个稀释度所种的孔数 R1=病变孔数 ∑=积和 LgCCID50/ml=LgCCID50/+ 2)Reed-Muench法 察看CPE,找出能惹起多半细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50 由表看出，能使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，此中间距离比率按Reed和Muench公式计算： TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比率 故能使50%细胞管发患病变的病毒稀释度为，即TCID50为倍，当病毒悬液 做倍稀释时，中含1个TCID50，作其余一些实验时（如中和试验），一般常用100TCID50/。 判断标准 细胞比较无病变，在无标准品时，应增添实验次数以减少偏差。