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雨生红球藻大体积室外培养实验研究 近年来，这种类黄酮已经进入国际开发领域，并在自然界广泛存在。根据研究，虾青素具有消除氧气自由基的能力。它的抗氧化性是类黄酮的10倍和维生素e的550倍，被称为“超级活性剂”。考虑到虾青素的卓越生理功能，它被应用于食品、医药等行业和水产养殖。根据该报告，红珍珠藻（hamashiping藻）可以在一定条件下积累超过1%的虾青素，这被认为是天然虾青素的“浓缩品”和最佳生物来源。因此，从红珍珠藻中提取虾青素已成为近年来国际虾青素研究的热点。 目前,国外建立封闭式跑道池培养系统开展雨生红球藻大规模室外培养;而国内仍处于实验室培养阶段,且实验基本在培养箱内完成.由此可见,我国在雨生红球藻开发利用方面,与国际水平仍存在差距,限制了利用雨生红球藻生产虾青素的大规模产业化进程.另一方面,目前开发利用得较成熟的螺旋藻、小球藻等已实现室外规模化生产.显然,开展雨生红球藻室外大体积培养研究,是实现雨生红球藻的大规模开发利用的必要条件.此外,尽管封闭培养条件下关于不同营养、胁迫方式等对雨生红球藻的影响报道甚众,但室外培养条件下,环境因子变化比较大,藻液体积大、且较易沾污,该情况下的影响迄今仍鲜有报道. 据此,本实验室在室外条件下,对雨生红球藻的品系选择、营养方式、胁迫条件等方面开展大体积培养的条件实验,考察上述不同条件下雨生红球藻的生长、虾青素积累及其他相关指标的变化,为雨生红球藻的室外规模化培养提供初步研究结果. 1 材料和方法 1.1 试验藻类 雨生红球藻原始藻种由中国科学院水生生物研究所藻种库提供.HPH、HPM品系由福建师范大学生物工程学院生物学系庄惠如老师提供. 1.2 室外培训的具体办法 (1) 生长情况的测定 采用BBM培养基,按照1∶4的比例将HPH、HPM和原始藻种分别扩养至10 L.四月初,在室外光强较为合适处(2 000～4 000 lx)培养.每天定时记录光强、温度和生长情况.指数生长期结束后搬至阳光直射处进行胁迫(6 000～40 000 lx),同时定时记录光强和温度. (2) 不同的营养方式的比较 光合自养采用BBM培养基,混和营养培养方式则以BBM培养基为基础,同时添加1 g/L NaAc作为碳源. (3) 道德胁迫对高光强胁迫下适应个体的影响 在第一阶段实验基础上,选取HPH、HPM和原始藻种中较适合室外培养的品系,以BBM配方为培养基,培养方式同前.共分为2组,其中1组在胁迫的同时添加NaAc,将盐度调节到2%.另一组则采用高光强胁迫,胁迫方式同前. 1.3 虾青素含量测定 采用血球计数板进行细胞计数.实验结束后,取50mL藻悬液,去上清液后干燥冷却至恒质量,计算单位体积藻粉产率.相关方法参见张英等(2004).采用高效液相色谱(HPLC)法对样品虾青素进行分析测定.色谱条件为:色谱柱为Hypersil ODS(5 μm,4.6mm×250 mm,Germany)色谱柱;流动相为水、乙腈和甲醇(75∶25∶10,by vol.);流速为1.0 mL/min;用二极管阵列检测器(DAD)在250～700 nm波长范围内扫描,在476 nm处进行检测;进样量为10 μL.详细方法见齐安翔等(2006). 2 结果与讨论 2.1 高水势梯度下不同品系微藻生长和虾青素积累的表现 图1为雨生红球藻HPH、HPM及原始藻种在室外大体积培养条件下的生长曲线.由图可见,与培养箱內小瓶(约100 mL)培养明显不同,室外开放条件下雨生红球藻的生长周期有所延长,达到9 d,且指数生长率较之封闭体系(0.33)明显下降.这主要是室外自然环境因子变化幅度较大,且藻液体积(约10 L)比培养箱内小瓶实验增加近100倍.另一方面,不同品系的微藻生长不尽相同:HPH和原始藻种的指数生长期并不明显,HPM品系则在第6天后呈现明显的上升趋势.HPM、HPH和原始藻种的指数生长率分别为0.22、0.11和0.10(图1).由此可看出,开放条件下,HPM的指数生长率虽然比培养箱封闭条件下明显降低,但仍显著高于相同培养条件下的HPH和原始藻种. 从胁迫情况上看(图2),胁迫的前3天HPH和HPM品系均有明显的增长趋势,其后各品系均呈现明显的下降趋势.HPH的死亡率最低,可见该品系在亚适宜条件下生存能力较强.HPH、HPM和原始藻种胁迫14 d后的孢子比率分别为33%、11%和42%,虾青素含量分别为1.19、1.35和0.84 mg/L(表1).可见,HPM品系的虾青素产率较高.齐安翔等(2006)在本实验室采用同样培养基,在培养箱中获得虾青素产率为8.7 mg/L,明显高于本研究,可见室外条件下光胁迫并不充分,这主要是由于藻液体积较大,透光率相对较差造成的.因此,大体积室外培养时,胁迫期间的光强条件还应有所增强. 综上