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基于三维荧光光谱的赤潮藻识别测定技术研究 浮游植物的荧光特征识别 有害浪潮遍布全国和世界沿海地区。这是国际社会普遍关注的海环境和自然灾害的重要课题。 赤潮频发对我国沿海的海洋生态、 资源、 环境造成了重大的经济损失。 要预防和减少有害赤潮灾害, 首先要能够准确、 实时地对发生赤潮的肇事藻种进行识别测定。 图像识别技术、 色素分析技术以及荧光技术等是目前常用的浮游植物种类鉴别技术。 荧光技术以其简单、 高灵敏度、 易实时检测以及良好的特异性等优点而倍受关注。 目前利用三维荧光光谱对赤潮藻进行识别测定多是利用赤潮藻活体的三维荧光光谱, 利用微藻生长过程中所产生的荧光溶解有机物(fluorescent dissolved organic matter, FDOM)的三维荧光光谱进行识别测定的研究鲜有报道。 本实验室曾发现不同微藻在生长过程中产生的溶解有机物荧光有所不同, 其荧光特征与藻种及其生长阶段有一定关系。 本文基于微藻生长过程中所产生的FDOM的三维荧光光谱, 用主成分分析和Bayesian判别法对我国沿海常见的10种赤潮藻进行分析判别, 尝试建立一种赤潮藻实时、 快速的荧光识别测定技术。 1 材料和方法 1.1 仪器和分析条件 采用Hitachi F-4500荧光分光光度计测定了溶解有机物的三维荧光。 测定参数参见文献。 1.2 藻液的预处理 表1列出了所选用的五种甲藻和五种硅藻, 分别取自中国科学院海洋研究所藻种室和中国海洋大学污染生态化学实验室。 实验中所用玻璃仪器均经HCl浸泡、 清洗、 高温灭菌(160 ℃, 1 h)后使用。 所用培养介质海水经0.45 μm滤膜过滤按f/2配方加入营养物质(甲藻不加硅营养盐)后蒸汽灭菌(121 ℃, 0.56 kg·cm-2, 30 min)。 培养温度(22±1)℃, 光照3 000 lux, 明暗周期12 h∶12 h。 每隔1～2 d取20ml藻液样品用GF/F膜过滤, 测定滤液荧光。 每个藻种平行培养3份, 其中一份的光谱数据作为训练集, 用于建立识别方法, 其余样品的光谱数据作为测试集, 用于所建方法的验证。 1.3 特征谱的选择和判别 实验获三维荧光光谱数据462个。 采用Milli-Q水空白消除拉曼散射, 将出现瑞利散射的地方置零。 然后将光谱进行归一化处理(以每个三维荧光光谱的最大值为基准)。 用主成分分析方法选取识别特征谱, 然后用Bayesian判别法进行判别。 利用Matlab 7.0软件完成以上数据分析。 2 结果与讨论 2.1 特征谱的提取方法 三维荧光光谱中水的散射峰的存在掩盖了光谱的本质特征, 本研究利用空白扣除法消除拉曼散射的影响, 将出现瑞利散射的地方置零, 消除瑞利散射的影响。 将去散射后的三维荧光光谱进行最大值归一化处理, 以消除荧光光强的影响。 然后对归一化后的光谱进行特征提取, 选取合适的识别特征谱。 光谱特征提取方法有很多种, 主成分分析的方法是常用的一种, 主成分分析对一组相关变量进行线性变换, 得到一组主成分, 主成分的维数和原始数据一致, 且相互正交, 用前几个主成分就可以代替原始数据, 并尽可能多地反映原始数据所提供的信息。 主成分分析常见的计算方法有非线性偏最小二乘、 乘幂法、 奇异值分解和特征值分解等, 它们的原理基本上都是基于特征值问题, 计算结果也基本相同。 本文采用奇异值分解的方法来实现。 首先对原始光谱做去散射和归一化处理, 然后依次进行奇异值分解, 选取分解得到的载荷矩阵第一列V1与得分矩阵第一列U1作为候选特征光谱, 一共得到462个V1和462个U1, 其中V1对应激发光谱, U1对应发射光谱, 分别将V1和U1按藻种顺序排列在一起, 得到激发和发射特征谱, 其三维图见图1。 显然, 不同藻种的V1和U1都存在显著差异, V1的同种藻特征光谱相似性比U1要好, 因此取V1作为识别特征谱进行判别分析。 2.2 识别种子分析 通过识别特征谱判别未知样品的种类归属, 是一种“有监督的”模式识别问题: 用一组已知类别的样本作为训练集, 对未知样品的种类进行判别, 常用的方法有Fisher判别法、 Bayesian判别法、 线性学习机和K邻域判别法等。 在光谱分析中, 通常是利用峰位置和强度等特征信息进行识别。 首先构造恰当的特征矢量, 选择适当的判别分析方法, 然后用相应的统计分析软件, 将测试集光谱与训练集光谱进行匹配, 就可完成未知样品的种类判别。 选用经典的Bayesian判别法对前面得到的识别特征谱进行判别分析, 结果见表2。 甲藻在种水平上的正确识别率≥92%, 硅藻在属水平上的正确识别率≥75%, 其中褐指藻属和角毛藻属的正确识别率≥90%, 中肋骨条藻的识别率较低, 为75%。 从识别结果可以看出, 利用