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厦门海域赤潮原因种的分离与鉴定 近年来，日本的赤潮发生得越来越多，这个地区也越来越大。它已成为世界上最重要的海上事件之一。赤潮研究也是目前海洋环境研究领域的重点。厦门西海域赤潮研究开始于国家“七五”发展计划时期,该海域赤潮的发生原因复杂,是环境污染、地理因素、气象因素和生物之间相互作用和生态适应等综合因素的作用结果。赤潮发生时,复杂的群落结构、共存的多物种及其生理代谢物质给常规赤潮监测带来了很大困难。赤潮生物(藻)形态的相似性和复杂性让训练有素的分类学专家亦很难在短的时间内利用常规光学显微镜方法将其准确地鉴定到种或亚种水平。对赤潮生物鉴定不准确或鉴定错误将对赤潮防治和早期评估带来很大困难。因此,开展海域典型赤潮原因种的检测(鉴定)和常规的监测、监视及相关方法的系统研究显得十分紧迫且非常必要。厦门西海域属于赤潮多发水域,有关赤潮动态、生消过程及其与其环境之间相互作用关系的跟踪研究已有许多报道。林金美、张水浸等报道了厦门附近海域有浮游甲藻约50余种。林元烧等首次报道了厦门海域出现微小亚历山大藻(Alexandrium minutum),是该种在中国沿海的首次记录。方琦等在厦门湾沉积物中发现13种甲藻孢囊,其中有毒和有害种各2种。顾海峰等对塔玛亚历山大藻(A.tamarense)和链状亚历山大藻(A.catenella)休眠孢囊的分布及萌发进行了研究。林元烧首次报道了在厦门地区的海域中存在着塔玛亚历山大藻,这些甲藻密度常常处于爆发赤潮的临界点上。蓝东兆等分析了厦门湾表层沉积物中甲藻休眠孢囊,发现了1种有毒的塔玛亚历山大藻休眠孢囊。林金美报道了厦门海域甲藻的分布情况,结果显示海洋原甲藻(Prorocentrum micans)为优势种类。国家海洋局已确定将厦门近岸海域作为国家级的赤潮监控区,持续开展了高频率、高密度的定点定时监视、跟踪监测,掌据了海域内赤潮的发生动态,对已发生的赤潮进行发展趋势预测,为赤潮防灾减灾提供了决策性依据。我们在近几年也对厦门海域经常发生赤潮的区域进行了常规监测采样工作,跟踪和记录了2003、2004、2005年夏季发生在厦门西海域的赤潮情况,采集了部分赤潮样品,并重点观测了其间发生的裸甲藻(Gymnodinuum)和原甲藻(Prorocentrum)赤潮,旨在为赤潮监测及减灾防灾提供基础资料。 1 材料和方法 1.1 海域样品采集 分别在2004年和2005年,对厦门海域进行周年采样,同时也根据这些海域赤潮发生的客观情况,实时地安排一些现场样品的采集。具体的采样测站详见图1。 1.2 海水体积浓缩 现场样品采集及固定方法:用采水器采集5～10 L表层海水,用10 μm筛绢过滤浓缩,将海水体积浓缩为100～200 mL;估计其体积,根据样品研究的需要分别加入1/10体积的多聚甲醛(10%),终质量分数为1%;或相应采用1%的鲁格氏碘液、4%的福尔马林、2.5%戊二醛进行固定,进行显微镜初检,测定藻细胞大小,选择适当的放大倍数和视野拍照保存。 1.3 细胞培养和分离 采用毛细玻璃管或10 μL的微量加样器在新鲜采集、未固定的样品中于体视显微镜下挑取单种藻的单细胞多个,根据实际情况可以先采用筛绢预过滤或加入f/2培养基预培养,置于多孔细胞培养板中,镜检观察并加入f/2培养基持续培养,逐步经过多次挑取和驯化培养后,待细胞长至一定密度时,可转移至培养瓶中正常培养。 1.4 培养条件的确定 将已经分离出来,并能正常生长的单种赤潮藻用0.45 μm滤膜过滤的海水煮沸后配成f/2培养基,在126 μmol photons/(m2·s)的光强,L∶D=12∶12的光周期和22℃的温度条件下进行单种培养。 1.5 cocter干部标准 参照侯建军等的方法,库尔特计数器为美国Beckman公司的MultisizerTM3 Coulter counter,采用100 μm的测定管,标准测定范围为1.4～42 μm。用于校正的显微镜为Zeiss Axioskop多功能显微镜。 1.6 乙醇、乙氧酯的脱水及膜电子显微镜wag 取固定的样品10 mL,用针筒过滤器过滤在2 μm的核孔膜(Millipore)上,用PBS洗涤3～4次,再顺序用15%、20%、30%、40%、50%、60%、80%、100%的乙醇梯度脱水(乙醇的梯度不可太大,逐级脱水10～15 min),最后两个梯度重复脱水2次,整个过程都要避免藻体暴露于空气中。然后以100%乙醇∶100%乙酸异戊酯=1∶1(V∶V)及100%的乙酸异戊酯进行置换30 min,保存在100%的乙酸异戊酯中。仪器为XL-30环境扫描电子显微镜(FEI公司),带有Peltier冷台。样品台温度调节范围4～5℃,电压:15.0 kV(根据实际情况实时调整),样品室气压调节范围0.13 ×102～