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药剂对蚯蚓急性毒性试验研究 蠕虫作为土壤无脊椎动物的代表，在保持和改善土壤结构、提高土壤肥力和改善土壤通气性方面发挥着重要作用。同时，它可以吸收和分解土壤中的有机物质。由于蚯蚓体型较大,对其生命周期内的很多参数都易测定。因此,蚯蚓在评价农药污染对土壤生态系统的影响方面有着独特的重要地位。与其它土壤无脊椎动物相比,蚯蚓和土壤污染的相关研究也相对丰富。敌敌畏和毒斯乐作为农业生产中最常用的广谱性农药,在环境中的残留、对人类和哺乳动物的毒性影响等研究虽然一直是环境科学的热点问题,但有关其长期暴露对中小型土壤动物生态效应的研究还不够深入(史雅娟等,2006)。本文探讨在土壤环境中敌敌畏、毒斯乐及其混剂对蚯蚓的急性毒性效应,旨在为进一步研究敌敌畏、毒斯乐对蚯蚓的蓄积毒性及分子毒理学效应,全面评价和控制其对土壤环境的污染提供依据。 1 材料和方法 1.1 基地质量环境因子试验 试验动物:蚯蚓Pheretima(在自然环境中获得,先预养1周,选择体重约300 mg,环带明显,大小和重量基本一致的成蚓进行试验)。 试验土壤:自然环境中较肥沃的耕作田,测定其pH值为6.0,有机质含量为4%,土壤采回后,在阴凉处风干,研细,过120目筛。 试验器材:培养箱(LRH-250生化培养箱),饲养小桶,直径15 cm的玻璃培养皿。 药物与试剂:80%敌敌畏乳油(主要化学成分:2,2-二氯乙烯基磷酸酯),21%毒斯乐乳油(主要化学成分:硫代磷酸酯)(河北新丰农药化工股份有限公司)。 1.2 测试方法 1.2.1 药物对照试验 将实验用农药分别溶于水中,混匀后按预备实验确定的剂量(药液5 mL)倒入垫有5张分析滤纸的培养皿中,以恰好湿润滤纸。放入清肠后的蚯蚓(每个处理各10条),将培养皿置19～21℃,相对湿度68%～82%和一定光照(间歇光照,即12 h光照,12 h黑暗)的培养箱中密闭饲养。隔24 h、48 h各计数1次,检查蚯蚓存活数,观察记录蚯蚓的死亡、生理状况以及毒性反应。蚓体对针刺无反应判为死亡。48 h后结束试验。每一浓度设置3个重复,并设置1个不含药物的对照(Qiu, 2000;左海根等, 2005;陈志伟等, 2007)。 1.2.2 清肠术后观察 称取500 g土样于试验小桶中,按不同等级浓度,加入含药品的蒸馏水,混匀。蒸馏水的用量为土壤重量的1/4。然后各放入10条清肠后的蚯蚓。在19～21℃,相对湿度68%～82%和一定光照(间歇光照,即12 h光照,12 h黑暗)的培养箱中密闭饲养。第7 d、14 d分别观察1次,记录死亡数、中毒症状,蚓体对针刺无反应判为死亡,14 d后结束实验。每一浓度设置3个重复,并设置1个不含药物的对照。 2 试验结果与分析 2.1 回归方程的建立及显著性检测 敌敌畏、毒斯乐及其混剂采用滤纸接触法在不同浓度下对蚯蚓的急性毒性试验结果见表1。滤纸接触法蚯蚓的中毒症状:身体变软,蠕动能力减弱,环带肿大而变透明、充血,有黄色液体渗出(徐建等,2006)。 根据表1的数据,分别以敌敌畏、毒斯乐及其混剂的浓度为横坐标,蚯蚓死亡数为纵坐标作标准曲线(图1),得48 h蚯蚓死亡数与敌敌畏浓度的回归方程为 y=33.571x+0.3929,R2=0.9897,48 h蚯蚓死亡数与毒斯乐浓度的回归方程为y=35.714x-0.5,R2=0.9827,48 h蚯蚓死亡数与混合药剂浓度的回归方程为y=32.85x+1.642,R2=0.924。并由各回归方程计算出:滤纸接触法中,敌敌畏、毒斯乐及其混剂对蚯蚓的48 h半数致死浓度(LC50)分别为0.14 g/L、0.154 g/L、0.102 g/L。由此可以看出,在滤纸接触法中,毒斯乐对蚯蚓的急性毒性较敌敌畏弱,而敌敌畏的毒性又较二者的混剂弱。 2.2 自然土壤法结果的应用结果 敌敌畏、毒斯乐及其混剂采用自然土壤法在不同浓度下对蚯蚓的急性毒性试验结果详见表2。自然土壤法蚯蚓的中毒症状与滤纸接触法相似,但稍轻。自然土壤法中蚯蚓症状出现快,死亡慢。土壤实验法的高浓度药物处理往往第1 d即出现症状,到第3 d时症状就非常明显,但出现明显症状时不会立即死亡,甚至到14 d实验结束时,还有些症状很明显、未死亡者。对照组的蚯蚓无死亡,表现活跃,无肿大、出血现象。 根据表2的数据,分别以敌敌畏、毒斯乐及其混剂的浓度为横坐标,蚯蚓死亡数为纵坐标作标准曲线(图2),得14 d蚯蚓死亡数与敌敌畏浓度的回归方程为 y=3.2857x+1.3571,R2=0.9281,14 d蚯蚓死亡数与毒斯乐浓度的回归方程为y=3.571x+0.357,R2=0.976,14 d蚯蚓死亡数与混合药剂浓度的回归方程为y=3.214x+1.892,R2=0.888。并由各回归方程计算出自然土壤法中,敌敌畏、毒斯乐及其混