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四川四川四川四川四川大安区部分乡镇猪瘟血清学检测 1 材料和方法 1.1 试验材料 1.1.1 血清比较 猪抗寒性血清和猪抗寒性血清由购买的实验盒提供。 1.1.2 猪血样的采集 采集2004年11月至2005年10月四川省自贡市大安区何市镇、大山铺镇、新店镇、三多寨镇、新民镇、永嘉乡、团结镇养猪场、户养的359头份猪血样，详细记录所采血样对应的猪的年龄、品种、地域分布等数据。 1.1.3 isa试验剂盒 酶联免疫吸附试剂盒购自美国IDEXX公司（批号06-03793-04）。ELISA试剂盒包括：96孔聚苯乙烯酶联板、血清稀释液、PBST洗液，稀释液Ⅰ、稀释液Ⅱ，标准猪瘟阳性血清、标准猪瘟阴性血清，抗猪IgG酶标抗体、酶标抗体稀释液，小牛血清、邻苯二胺（OPD）、H2O2、底物缓冲液、终止液（H2SO4）。 1.1.3 设备 1.2.2 离心2.2 将所采集的血样置37℃恒温箱中温浴30 min, 再经2 000 r/min离心5 min，静置后分离上层血清于另一洁净的试管，-20℃保存备用。 1.2.3 样品处理 将分离到的血清样品按采集地点、猪的年龄编号。 1.2.4 免疫吸附试验 1.2.4. 1清洁板 用移液器取PBST加入到ELISA板的孔中，250μL/孔，室温洗涤3 min后，用力将孔中的洗液甩干，重复洗涤3次。 1.2.4. 稀释液的加入 用移液器向血清稀释板的每孔中加入血清稀释液245μL，然后向相应的孔中加入待检测血清、阴性血清和阳性血清各5μL，并留一孔只加血清稀释液作为调零孔。 1.2.4. 血清加吸孔 将稀释的各血清用移液器加入到ELISA板的孔中。每份待检血清加一孔，阴、阳性各加两孔，100μL/孔，并留一孔加血清稀释液作为调零孔，37℃湿盒作用60 min。 1.2.4. 4、清洁板 用力将孔中的洗液甩干，用移液器取PBST加入到ELISA板的孔中，250μL/孔，室温洗涤3 min后，重复洗涤3次。 1.2.4. 5.加入酶二甲酯 将抗猪IgG酶标抗体、酶标抗体稀释液以及小牛血清三者合并混合，然后用移液器加入到反应孔中，10μL/孔，37℃湿盒作用60 min。 1.2.4. 6清洁板 用移液器取PBST加入到ELISA板的孔中，250μL/孔，室温洗涤3 min后，用力将孔中的洗液甩干，重复洗涤3次。 1.2.4. 双氧水回收反应 临用前将OPD药片加入到底物缓冲液中，溶解后再加入双氧水50μL，摇匀。然后用移液器加入到各反应孔中，100μL/孔。室温避光作用30 min。 1.2.4. 8停止 用移液器将终止液加入到反应孔中，50μL/孔。 最后，用酶标仪读出OD450光密度值。 1.3 ocking、关于可疑的判定 阴性对照OD450应大于或等于0.5，阳性对照Blocking百分比应大于50%。 Blocking≥40%判定为阳性；Blocking在30%～40%判定为可疑；Blocking≤30%判定为阴性。群体的免疫保护率可按下式计算： 保护率在85%以上者为免疫良好猪群, 小于50%者为免疫无效或猪瘟不稳定群体, 需重新加强免疫, 以清除不稳定因素。 2 结果 2.1 抗体检测结果 将从四川省自贡市大安区何市镇、大山铺镇、新店镇、三多寨镇、新民镇、永嘉乡、团结镇养猪场、散养户中采集到的血液样品统一编号并记录后进行抗体检测。总共采集到血液样品359头份，其中何市镇78份，大山铺镇66份，新店镇55份，三多寨镇42份，新民镇82份，永嘉乡20份，团结镇16份。经检测后，血清抗体阳性数分别为39、18、15、14、44、10和5头份，可疑血清数分别为5、2、5、0、0和0头份，阳性率分别为50.0%、27.27%、27.27%、33.33%、53.66%、50.00%和31.25%（详见表1）。 2.2 猪份，青年猪率高 按计划在采集血液样品时共采集2月龄仔猪、3月龄仔猪、青年猪、种公猪、经产母猪239头份，其中2月龄仔猪血清46份，3月龄仔猪47份，青年猪83份，种公猪21份，经产母猪42份。经检测，抗体阳性数分别为16、18、63、16、30份，阳性率分别为34.78%、38.30%、75.91%、76.19%和71.43%，未见可疑血清样本（结果见表2）。 2.3 阶段猪抗体阳性的情况 本次试验采集了自贡市大安区7个乡镇的5个不同年龄阶段猪的血液样品共359头份，抗体阳性总数为145份，可疑血清数为12份，抗体总阳性率为40.33%，群体免疫保护率为42.89%（详见表3）。 3 讨论与分析 3.1 猪年免疫水平差异产品血样的采集 本试验所采集的359份血液样品都来自自贡市大安区的7个乡镇，充分考虑到了血液样品的地域分布和样品代表性，同时考虑到不同年龄阶段猪的免疫水平的差异，也