对啶酰菌胺敏感性不同的币斑病菌致病性分析.docxVIP

? ? 对啶酰菌胺敏感性不同的币斑病菌致病性分析 ? ? 赵正阳， 索 欣， 陈 玲， 刘雄洲， 胡 健， 尹淑霞* (1.北京林业大学草业与草原学院， 北京 100083； 2.南京农业大学草业学院， 江苏 南京 210095) 匍匐翦股颖(Agrostisstolonifera)为禾本科(Poaceae)翦股颖属(Agrostis) 多年生冷季型草坪草，具有较强的耐寒性、耐阴性，极耐低修剪，坪观质量好，被广泛用作冷凉地带高尔夫球场果岭草坪等运动场建植[1-3]。 币斑病是匍匐翦股颖草坪的重要病害之一，该病由币斑病菌为害引致[4-5]。最新的研究[6-7]将币斑病菌归在Clarireedia属，分为Clarireediahomoeocarpa，Clarireediabennettii，Clarireediajacksonii，Clarireediamonteithiana和Clarireediapaspali5个种。研究表明，草坪修剪高度过低、修剪频率过高都会加速该病原菌的侵染[8]。币斑病发生后，如不及时处理将会严重影响草坪的观赏和使用价值。 当前翦股颖币斑病主要依靠化学防治，而频繁施用化学药剂易使币斑病菌产生抗药性[9-10]。国内外关于草坪币斑病菌抗药风险的研究多集中在病原菌自身的抗性频率与对不同药剂的交互抗性等方面，例如通过田间采集抗药性菌株，室内对其进行杀菌剂的敏感性测定，或者运用分子生物学方法揭示抗药性机理[11]。植物病原菌对杀菌剂的抗性风险由病原菌自身与药剂共同决定[12-13]。啶酰菌胺通过抑制琥珀酸脱氢酶的活性，抑制病原菌孢子萌发与菌丝生长，不易与其他类型杀菌剂产生交互抗性，国外早在2004年便使用啶酰菌胺对草坪币斑病进行有效防治[14-15]。但该杀菌剂在国内草坪管理中尚未广泛应用，目前不仅缺乏病原菌对啶酰菌胺的抗性风险评价研究，而且对于病原菌对啶酰菌胺敏感性降低后其致病性是否会变化亦没有明确结论。本研究旨在通过对啶酰菌胺不同敏感性的币斑病菌致病性等特性进行研究，为啶酰菌胺的抗药性风险评定奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料 采自天津3家高尔夫球场(龙海高尔夫俱乐部，滨海湖高尔夫俱乐部和滨海森林高尔夫俱乐部)的币斑病菌菌株106株，98%啶酰菌胺(boscalid)原药购自湖北薪和化工有限公司，匍匐翦股颖品种‘克罗米’(‘Kromi’)的种子来自本实验室。 1.2 试验方法 1.2.1币斑病菌对啶酰菌胺的敏感性测定 参照聂秀美[16]的方法对采自天津的币斑病菌分离、纯化。采用基础培养基(MM)[17]测定币斑病菌对啶酰菌胺的敏感性。将啶酰菌胺原药用丙酮配置成终浓度为质量浓度1，10，100，1 000 μg·mL-1的含药平板。将菌株在MM培养基上,25℃黑暗条件培养3 d后，在边缘打取5 mm菌饼，接种至各浓度药板上，每浓度重复3次，同时在空白对照中加入等体积的丙酮。于25℃恒温培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测量各处理菌落直径计算菌丝生长抑制率，求出毒力回归方程和抑制中浓度(EC50/μg·mL-1)。以Chang[18]报道的币斑病菌对啶酰菌胺的敏感基线4.67 μg·mL-1为参照，计算菌株的抗性水平，对抗性进行分级。 敏感菌株(SS)：R10，低抗菌株(LR):10≤R≤50，高抗菌株(HR)：R≥100[19]。 1.2.2菌落形态与同源性比对分析 从每种抗性菌株中随机挑选2株，分别命名为高抗株(HR1，HR2)，低抗株(LR1，LR2)和敏感株(SS1,SS2)。6株菌株置于25℃恒温黑暗培养14 d，观察菌落形态并拍照。 参考章武[5]的方法，合成rDNA-ITS区通用引物ITS-1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)(北京科百奥生物技术有限公司合成)，以6个币斑病菌菌株的基因为模板进行PCR扩增，将PCR产物委托睿博兴科(北京)有限公司进行DNA测序。将测序返回的基因序列与Gen-Bank核酸数据库进行比对，并用MEGA 7.0进行系统发育分析和进化树构建，用Neighbor-joining法构建进化树，自展次数为1 000次。 1.2.3病菌生长速率和生物量测定 将菌株活化后，用直径6 mm的打孔器打取菌饼，菌面朝上，分别放置在普通马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基和表面铺有灭菌玻璃纸的PDA培养基上，每个菌株接种3皿，于25℃恒温恒湿培养箱中黑暗培养3 d，采用十字交叉法测定菌落直径，单位为mm，计算病菌生长速率；将长有菌丝的玻璃纸取出，刮下表面菌丝并称重[20]。每皿重复3次。 1.2.4病菌草酸产量测定 菌株活化后，分别取3枚菌饼放置在25 mL锥形瓶中，瓶中加入15 mL无菌