等离子体活化水-苯乳酸协同杀灭大肠杆菌O157-H7作用及机制研究.docx

? ? 等离子体活化水-苯乳酸协同杀灭大肠杆菌O157:H7作用及机制研究 ? ? 赵电波，王少丹，郑凯茜，相启森，王博华，张琪帆 （1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450001；2.河南省冷链食品质量与安全控制重点实验室，河南郑州 450001） 等离子体活化水（Plasma-activated water，PAW）又称为等离子体处理水（Plasma-treated water，PTW），主要通过低温等离子体放电装置在水表面或水下放电而产生，富含活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）等物质。PAW 是一种新兴的非热杀菌技术，在食品保鲜领域具有广泛的应用前景[1]。但研究发现，蛋白质、脂质等食品组分会显著降低PAW 对微生物的杀灭效果，因此需要和温热、防腐剂、表面活性剂等协同使用以增强杀菌效果[2-7]。Choi 等[5]发现，经PAW和60 ℃温热协同处理后，腌制白菜中的菌落总数和接种的食源性致病菌数量均显著减少。此外，PAW与尼泊金丙酯等防腐剂联合使用时其杀菌效果也显著增强[6-7]。例如，PAW 和4 mmol/L 尼泊金丙酯联合处理10 min 后，大肠杆菌O157:H7 减少了6 lg CFU/mL，而PAW 和尼泊金丙酯单独处理组仅分别降低了1.54 和2.18 lg CFU/mL[6]。 苯乳酸（Phenyllactic acid，PLA）又名β-苯基乳酸或3-苯基乳酸，是一种具有广谱抑菌作用的生物防腐剂，对细菌和大部分真菌具有良好的抑制作用[8-9]。与传统化学防腐剂相比，PLA 具有安全性高、来源广泛、稳定性强、亲水性好等优点。已有报道证实PLA 可降低乳制品、焙烤类食品中的微生物数量，其在食品保鲜领域的应用受到广泛关注[10-11]。前期研究发现，PAW 与PLA 有良好的协同杀菌效果，但其作用机制尚不明确。因此，本研究以常见的大肠杆菌O157:H7 为研究对象，评价PAW 与PLA 的协同抗菌作用，并通过评价细胞形态、细胞膜完整性、细胞膜电位和胞内活性氧水平等指标揭示其协同杀菌作用机制。研究结果将为PAW 和PLA 在食品保鲜领域中的应用提供理论参考。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 大肠杆菌O157:H7 中国工业微生物菌种保藏中心；胰蛋白胨大豆琼脂培养基（Tryptone soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptone soy broth，TSB） 北京奥博星生物技术有限责任公司；L-苯乳酸和DiBAC4（3） 上海麦克林生化科技有限公司；乙酸异戊酯和磷酸二氢钾 天津市科密欧化学试剂有限公司；50%戊二醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）上海源叶生物科技有限公司。 TS-PL200 型等离子表面处理机 深圳东信高科自动化设备有限公司；MJ-54A 型高压灭菌锅 施都凯仪器设备（上海）有限公司；TGL-16M 型台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台 苏净安泰设备有限公司；Tecan Spark 20 M 型多功能微孔板读数仪 瑞士Tecan 公司；JSM-7001F 型场发射扫描电子显微镜 日本JEOL 公司；Nano Drop 2000 型超微量分光光度计 美国Thermo 公司。 1.2 实验方法 1.2.1 菌悬液制备 从-80 ℃冰箱中取出甘油管保存的大肠杆菌O157:H7 菌种，挑取一环菌液在TSA培养基上活化培养后，挑取活力旺盛的单菌落接种于TSB 培养基中，于37 ℃、180 r/min 恒温振荡培养12 h。取7 mL 培养物于10 mL 离心管，于3500×g离心5 min，弃上清液，所得菌体用0.85%无菌生理盐水洗涤2次，离心同上。将所得菌体重悬于无菌生理盐水中并混匀，制成活菌数约为7～8 lg CFU/mL的菌悬液，备用。 1.2.2 PAW 的制备 参考Zhang 等[12]的方法，采用等离子表面处理机制备PAW，冷等离子体与液面的距离为0.35 cm，功率为750 W，工作气体为压缩空气（0.18 MPa）。将200 mL 无菌去离子水（Sterile distilled water，SDW）经APPJ 装置处理60 s 得到PAW，备用。 1.2.3 PLA 杀菌活性评价 将PLA 溶解于去离子水并经0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，并稀释到1.25、2.5、5 和10 mg/mL。然后将100 μL菌悬液、800 μL 0.85%无菌生理盐水和100 μL PLA溶液充分混匀，PLA 最终浓度分别为0.125、0.25、0.5 和1.0