乌头汤对大鼠肝药cpy3a4活性的影响.docxVIP

乌头汤对大鼠肝药cpy3a4活性的影响 cyp3a4是大多数p450酶之一，参与大约50%药物的生物转化。同时,CYP3A4酶的活性也被许多药物抑制或诱导,从而引起药物间的相互作用。因此,明确常用药物对CYP3A4活性的影响对预测药物间相互作用,提高药物合用的有效性和安全性具有重要意义。 乌头汤为温经止痛法治疗寒湿痹证的经典方剂,临床常随证配伍中药或西药使用且收效良好。目前有关乌头汤的研究多从药效物质基础的角度开展,而从CYP介导的代谢性相互作用方面的研究尚未见报道。本实验选用大鼠肝微粒体混合酶体外代谢体系,以睾酮为探针,采用超高效液相色谱(UPLC)测定6β-羟基睾酮的生成量,计算其代谢速率并评价CPY3A4活性的变化,旨在探索乌头汤与CPY3A4底物药物合用时产生药物间相互作用的可能性。 1 材料表面 1.1 特芬材料 麻黄、芍药、黄芪、制甘草、制川乌均购自北京华邈中药工程技术开发中心。 1.2 动物 SPF级健康成年雄性SD大鼠,体重180～220 g,购自广州中医药大学实验动物中心,许可证号 SCXK(粤) 2008-0020。 1.3 还原型氧化酶抑制剂的合成 睾酮、6-β羟基睾酮(nacalaitesque,纯度98%),吉非贝齐(内标,Sigma-Aldrich,纯度98%),乙腈(色谱纯,merck),solutionA,B (还原型辅酶ⅡA,B溶液, BD biosciences),苯甲基磺酰氟化物(PMSF,Sigma-aldrich),二硫苏糖醇(DTT,Sigma-aldrich)。 UPLC(Agilent),Elix超纯水系统(Milipore),BT25S型精密电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司),5810R型高速离心机(Eppendorf),CS150NX型超高速离心机(Hitachi),MS3 digital型涡旋振荡器(IKA),pH计(Mettler Toledo),酶标仪(BIO-RAD)。 2 方法 2.1 各组原方剂量及未剂量剂量对杂汤原方剂量的影响 50只SD雄性大鼠随机分为空白对照组、抑制剂SKF-525A组(0.1 g·kg-1)、乌头汤高剂量组(原方剂量2倍)、乌头汤中剂量组(原方剂量)、乌头汤低剂量组(原方剂量1/2)。连续灌胃给药7 d,空白对照组给予等量的水。 2.2 睾酮、6基酮和jibeece内标的配置 精密称取睾酮、6β-羟基睾酮、吉非贝齐适量,以乙腈溶解分别配置成12,6,10 mol·L-1的储备液,-20 ℃保存备用。 2.3 匀浆、匀浆的制备 大鼠连续诱导7 d后,乌拉坦麻醉,用冰冷的肝脏冲洗液在体冲洗肝脏。洗净血液后的肝脏取出在4 ℃切碎,并用冰冷的匀浆缓冲液匀浆。匀浆液10 400 r·min-1离心15 min;取上层35 000 r·min-1离心1 h,得肝微粒体。所得肝微粒体用250 mol·L-1蔗糖混悬均匀,-80 ℃保存备用。用考马斯亮蓝法测定肝微粒体总蛋白浓度。 2.4 -三醇解氨肝微粒体终止反应 加入450 μL 磷酸盐缓冲溶液,25 μL Solution A,5 μL Solution B,10 μL肝微粒体悬液,37 ℃,150 r·min-1水浴摇床孵育5 min,再加入睾酮(终浓度分别为4,10,30 μmol·L-1)继续孵育(时间分别为7,7,15 min)后,立即加入4 mL冰冷二氯甲烷终止反应。 2.5 rmin-1离心 取2.4项下终止代谢的样品,加入10 μL吉非贝齐(内标),涡旋8 min后 1 000 r·min-1离心15 min。取下层3.5 mL于真空干燥箱中吹干。残渣加入100 μL乙腈涡旋3 min,再加入100 μL双蒸水,涡旋3 min,13 000 r·min-1离心30 min,取上清10 μL,UPLC进样分析,以6β-羟基睾酮的生成量计算代谢速率。 2.6 流动相a乙腈b的检测 色谱系统:Agilent 1290 Infinity UPLC System,Agilent RRHD SB-C18色谱柱(3.0 mm×100 mm,1.8 μm),柱温40 ℃,进样体积10 μL,流速0.4 mL·min-1,流动相A 乙腈,流动相B 水(0～2.5 min,70%～10% B;2.5～4 min,10%～50% B;4～5 min,50%～70%流动相B,5～6 min,70%流动相B。检测波长 235 nm,洗脱时间6 min。UPLC图见图1。 2.7 统计处理 实验数据用xˉ±sxˉ±s表示,采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。P0.05为有统计学意义。 3 结果 3.1 线性关系检验 以睾酮和6β-羟基睾酮浓度为横坐标(X),睾酮和6β-羟基睾酮峰面积与内标峰面积比值