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聚蔗糖-复方泛影葡胺细胞的制备及漂浮密度的确定 杏仁中子细胞（pmn）是血液中特定神经系统中的第一个防细胞，约占总细胞总数的70%。血液中的分离是研究物理、统计学特性和功能的主要过程。PMN寿命较短,其合成能力有限,缺少修复能力,一旦被激活就产生一系列变化,最终被排斥、吞噬。PMN在血管中存活的时间平均只有6 h～8 h,分离的PMN在体外的存活时间更短,而且尚无理想的保存方法。用不同方法分离的PMN其存活时间及活性也有较大的差别,试验根据不同的研究目的,考虑到细胞纯度、获得量和活力等几方面因素,经过反复摸索,优化了3种适合于不同研究目的分离方法,当然这几种方法也有相互重复的环节。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 细胞剂和细胞剂 右旋糖苷T-500,Percoll分离液,Ficoll-400,760 g/L复方泛影葡胺,EDTA,Hanks平衡盐溶液,RPMI 1640,小牛血清,400 g/L的聚蔗糖。 1.1.2 实验动物 长春市示范奶牛场健康、泌乳中期荷斯坦奶牛。 1.2 方法 1.2.1 浮力密度与浮力层的密度 细胞分离液的配制:用400 g/L的聚蔗糖液Ficoll-400以无菌双蒸水配成90 g/L聚蔗糖溶液,此为A液,浮力密度为1.028;用760 g/L复方泛影葡胺以无菌四蒸水配成340 g/L的溶液,此为B液,浮力密度为1.198。根据公式D=(dAVA+dBVB)/(VA+VB),计算出A、B两液不同体积混合后的细胞分离液漂浮密度(表1)。 取8支10 mL硅化玻璃试管,编号(1～8),按密度从低到高的顺序分别加入细胞分离液4 mL。 取同一头奶牛的EDTA抗凝血2 mL与等量Hanks液充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于上述试管的分离液面上,保持界面清晰。静置30 min后,2 000 r/min离心20 min。 离心后管内分为4层,上层为血浆和Hanks液,下面相连依次是云雾细胞层、分离液层、实细胞层。 对云雾细胞层和实细胞层分别镜检,确定细胞性质并找出云雾层细胞是PMN的试管,确定奶牛PMN细胞层与细胞分离液A液与B液的构成比例的关系。 1.2.2 percoll分离液体积比的确定 将Percoll原液与87.7 g/L的氯化钠溶液以9∶1(V/V)的比例混合,定为100% Percoll,再用灭菌生理盐水配制60%及75%的Percoll分离液(体积比),其中60% Percoll密度为1.079,75%Percoll密度为1.090。 1.2.3 细胞外包rpmi-1330 ①EDTA抗凝血,细胞计数,取2 mL抗凝血,1 500 r/min水平离心15 min。先吸取上层血浆,离心获得无血小板血浆(PPP)用以重悬粗提的白细胞。再吸取富含白细胞的“云雾细胞层”,放入另一试管,再加入2 mL Hanks液,混匀。②缓慢加于预置8 mL 75% Percoll液和1 mL PPP的硅化试管(PPP在上层),注意保持两液界面的完整性。2 000 r/min水平离心20 min。③取位于分离液界面上的白色层带,以吸管小心移入另一预置的4 mL 60%液Percoll的试管中,2 000 r/min水平离心20 min。④弃去上清,加入3 mL PBS洗涤细胞2次。然后用含100 mL/L犊牛血清的RPMI-1640培养液调整所获细胞浓度为1×106个/mL。另取40 μL稀释,涂片,瑞特氏染色、镜检。台酚蓝染色,细胞计数求PMN的回收率,并观察细胞的形态。 1.2.4 底层红细胞的制备 ①取EDTA抗凝血2 mL,加入200 μL的 60 g/L Dextran,在37 ℃水浴中静置 45 min,使红细胞沉淀。②将上层白细胞加于预置的4 mL 60% Percoll的试管中(保持界面清晰),2 000 r/min水平离心20 min,底层为PMN和少量的红细胞。③弃去上清,加入双蒸水1 mL溶血30 s,再加入2倍量PBS 1 mL,混匀,使PMN恢复等渗状态,1 500 r/min离心20 min,用PBS洗 2次,再以1.2.3的方法求PMN的回收率,并观察细胞的形态。 1.2.5 离心条件:1 ①取EDTA抗凝血2 mL,加入8 mL红细胞裂解液,混匀后静置3 min。1 500 r/min水平离心20 min。②弃去上清,加入2 mL Hank′s液,充分混匀后加于预置6 mL 60% Percoll试管的液面上,1 500 r/mim水平离心20 min 。③保留最底层的PMN层,以1.2.3的方法求PMN的回收率,并观察细胞的形态。 2 结果 2.1 牛血液中各种细胞成分的浮密度 由表2可知,PMN的漂浮密度在1.080～1.085之间,淋巴细胞的漂浮密度在1.052～1.