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内生菌与药用植物活性成分提取的关系 白牙，又名八角牛、野胡椒和羊泽草，是广州科的一种多年生草本植物。根皮用药。中药被称为白牙皮，具有清热解毒、祛热、利尿、除湿、杀虫等功效。皮肤瘙痒、湿疹、伤口、黄疸、肝炎和阴胃瘙痒。根含生物碱，主要有白鲜碱、黄柏酮等，叶含芸香甙、挥发油等。白鲜生于海拔200～900 m之间的山坡、林下、林缘或草甸，分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、陕西、甘肃、山东、江苏、江西、安徽、湖北等地。 白鲜皮有解热作用，对多种致病菌有不同程度的抑制作用。我国民间外用其根为止血药，白鲜叶可提取芳香油，根茎作农药用，可防治多种病虫害。目前，国内外利用植物防治病虫害的研究和报道较多，但对白鲜的研究主要集中在化学成分、药理活性、栽培等方面。 内生菌广泛分布在各种植物中，近年来，从蔬菜、花卉、药用植物等多种植物中分离到了大量内生菌，内生菌可以调节宿主植物生长、增强抗性、促进植物次生代谢产物的合成等。研究表明，许多内生菌能帮助植物抵抗病虫害提高植物的抗逆性，并已从多种植物中分离出了具有此种作用的内生菌。植物内生菌是个潜力巨大、尚待开发的微生物新资源。现有的报道中，未发现白鲜内生菌的研究，为了解白鲜内生菌的种类及组成，采用组织分离法进行了白鲜内生菌进行分离与培养。 1 材料和方法 1.1 试验材料 2012年6月采于通化师范学院植物园的健康、无病虫害的野生白鲜植株，用清水洗净表面泥土后备用。 1.2 菌种分离、培养 菌种分离所用培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（用于细菌的分离、培养）；PDA培养基（用于真菌的分离、培养）；高氏Ⅰ号培养基（用于放线菌的分离、培养）。 培养基采用湿热灭菌法灭菌：121℃维持15～20 min。 1.3 牛肉膏蛋白、pda及高氏号培养 取新鲜健康的白鲜根、茎、叶，用洗衣粉清洗干净，然后切成长段，用滤纸吸干表面水分，在无菌室进行表面消毒。无菌水冲洗2遍，用75%乙醇浸泡叶子1 min，根、茎1.5 min，无菌水冲洗3～4遍,再用0.1%升汞浸泡叶1 min，根、茎1.5 min，无菌水冲洗4～5遍。将白鲜的根和茎切成2 mm的小段，叶切成5 mm2的小块，接种，每个平皿接10个外植体，每部位重复2次，同时做空白。牛肉膏蛋白胨培养基于37℃恒温培养24 h,PDA培养基于28℃恒温培养3～5 d，高氏Ⅰ号培养基于28℃恒温培养5～7 d。纯化，斜面保存菌种。 观察根、茎、叶侧面或顶端的菌落形态，通过单染色和革兰氏染色，观察细菌形态并进行鉴定。 2 结果与分析 通过对白鲜根、茎、叶中内生菌的分离，共分离出13种内生细菌，其中杆菌有12种，球菌有1种，具体情况如下。 2.1 生物量的多样性 由表1可知，白鲜不同部位内生细菌种类和数量有差别，茎和叶中内生菌种类较为丰富，根中的内生细菌种类较少，这可能是内生菌对宿主的选择性及适应性所导致的结果。 2.2 革兰氏染色分析 从PDA培养基中分离到的内生菌，根、茎各1种，叶2种,在显微镜下观察革兰氏染色的结果，可以判断这些内生菌都为细菌。而PDA培养基是用来分离真菌的，此试验未分离到真菌，可能是由于外植体消毒效果不好或是培养基配方不适于真菌生长引起的。 2.3 染色细菌形态分析 图7（封三）是从高氏Ⅰ号培养基上分离到的内生菌，菌落形态类似放线菌，菌丝较细，无气生菌丝，呈放射状伸到培养基内部和表面，不易挑取。单染色后，其细菌形态为杆菌，革兰氏染色后呈阴性，通过观察该菌的外形可以判断这两种菌属于细菌。因此从高氏Ⅰ号培养基上未分离到放线菌。 3 牛肉膏蛋白培养基中内生细菌的分离和最佳培养方法 植物内生菌作为植物微生态系统中重要的组成部分，对增强宿主植物对环境适应能力具有重要意义，内生菌与宿主植物在长期的协同进化过程中构成了一种稳定的生态关系。本试验采用组织分离法对白鲜根、茎、叶的内生菌进行分离培养，共分离出13种内生细菌，其中12种杆菌，10种革兰氏阳性菌，2种革兰氏阴性菌，1种球菌为革兰氏阴性菌。同时发现，同一种内生细菌可在白鲜不同部位生长。 本试验牛肉膏蛋白胨培养基中分离出的细菌比较多，而PDA培养基和高氏Ⅰ号培养基中未分离出相应的真菌和放线菌，只分离出了细菌，可能是由于外植体消毒效果不好或是培养基配方不适于真菌和放线菌生长引起的。 药用植物体内存在大量丰富的内生菌，往往具有抑制病原菌、协助宿主抵抗病原菌和促进宿主植物生长的作用。本试验意外发现，在牛肉膏蛋白胨培养基上，根周围出现了抑菌圈（图8，封三），白鲜以根皮入药，现有成药多用于杀菌、消炎，本试验发现抑菌圈符合白鲜的药理作用。光学显微镜下观察抑菌圈外的细菌形态，为革兰氏阴性短杆菌。