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海带渣固体发酵产植物激素6-糠氨基嘌呤的研究 传统农业主要依靠化学农药和化学肥料的使用。为了在高产生产中取得成功，农业生产者经常使用化学农药和化学肥料，导致化肥和土壤肥力不足、土壤养分失衡、土壤侵蚀、土壤侵蚀、，河流和地下水污染等问题。为了自身改善，减少了对外部不利条件的抵抗力，并影响了我国农业的可持续发展。与此同时随着人们对食物品质要求的提高, 以及对有害生物综合治理与有害生物生态治理认识的加强, 现在科研工作者越来越多的把目光投到植物与微生物之间的作用, 以及植物与其所在生态环境中的各个因子之间的相互作用上, 因此分离筛选具有多种PGPR特性的微生物肥料菌株, 成为广大微生物科研工作者的研究重点。微生物肥料的应用也已被证明是农业可持续发展的有效途径, 是生产绿色食品的重要内容.目前微生物肥料在多种作物上得到广泛应用, 并取得了良好的经济效益、社会效益与生态效益。 海带是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物, 它含有许多陆生植物不具有的碘、钾、镁、锰和钛等微量元素以及海藻多糖、甘露醇等。有研究证明, 海带中含有大量的高活性成分和天然植物生长调节剂, 可刺激植物体内非特异性活性因子的产生, 能促进作物生长发育, 提高产量。目前我国的海带加工主要是提取碘, 这个过程同时会产生大量的废弃物海带渣。海带渣中的主要成分为海藻纤维、蛋白质、海藻多糖、壳聚糖、多酚和甜菜碱等, 现阶段除了部分作为饲料使用, 大多都当作工业垃圾处理了。利用海带渣生产有机肥, 生产有机燃料, 等, 不仅可以减少对环境的污染, 还能充分利用其中多种未被利用的营养物质和活性成分, 有效地变废为宝。 响应面分析法是20世纪中后页发展起来的优化实验条件的统计学方法, 能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件, 优化效果好, 在微生物发酵方面已经得到了广泛的应用。 本研究旨在通过对一株具有潜在应用价值的枯草芽孢杆菌菌株进行海带渣的固体发酵, 研究其以海带渣为基本培养基进行固体发酵的特性, 通过单一因素实验和响应面实验进行产抑制寄生曲霉活性物质的发酵条件优化。 1 材料和方法 1.1 曲霉突变菌株的分离培养 实验室分离得到的具有应用潜力的生防枯草芽孢杆菌JGA2 (-5) 27-2;能积累红色黄曲霉毒素中间产物的NA突变寄生曲霉突变菌株;GY固体培养基:20 g/L葡萄糖, 5 g/L酵母粉, 20 g/L琼脂;GY液体培养基:20 g/L葡萄糖, 5 g/L酵母粉。海带渣、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、酵母粉、牛肉膏、Na NO3和 (NH4) 2SO4、NH4NO3等。 1.2 高效液相色谱法检测高效活性 接种母液:将试管斜面上的生防枯草芽孢杆菌JGA2 (-5) 27-2取一环接种到装有20 m L GY培养液的三角瓶中进行35℃, 150 r/min, 条件下的摇床培养, 培养12 h。 海带渣的固体发酵:对海带渣进行粉碎 (0.5mm) ;采用培养瓶进行海带渣的固体发酵, 每个培养瓶中装40 g干海带渣与60 m L的去离子水, p H值为自然, 灭菌。按照4%的接种量 (4 m L) 将接种母液接种到灭菌后的固体培养基中进行固体发酵。发酵温度为35℃, 发酵时间为9 d。 发酵产物p H值的测定:取5 g发酵产物到装有50 m L蒸馏水的三角瓶中, 充分振荡2到3 min, 静置1 min后用p H计对液体的p H值进行测定。 海带渣固体发酵产物水提取液:取5 g发酵产物到装有45 m L蒸馏水的三角瓶中, 振荡30 min, 10 000 r/min转离心15 min, 取上清, 用0.22μm微孔滤膜过滤, 过滤液备用。 96孔板检测对寄生曲霉的抑制活性:实验采用96孔板微培养来对发酵产物水提取液的抑制寄生曲霉的活性进行检测。先在96孔板的每个孔中加60μL GY固体培养基, 然后将各处理的提取液 (或者稀释后的提取液) 按照60μL的量添加到孔中, 每个处理3个重复, 每个孔中接种5μL寄生曲霉孢子。将96孔板放置培养箱中进行28℃条件下的保湿培养, 培养4~6 d后观察每个孔中寄生曲霉的生长与产红情况。对96孔板分析不能得到较好结果的需要进一步的采用Tip-culture法进行定量分析。 植物激素细胞分裂素的测定:利用高效毛细管电泳法对发酵产物水提取中的植物激素细胞分裂素进行检测。电泳操作条件如下:未涂层石英毛细管 (50μm×57 cm, 有效检测长度48 cm) ;运行缓冲液20 mmol/L硼砂缓冲液 (p H 9.0) ;20 mmol/L磷酸二氢钠溶液;检测波长200 nm;分离电压20 k V;温度28℃;重力进样20 s (高度10 cm) 。毛细管柱使用前用0.1 mol/L的Na OH、水、电泳缓冲液分别冲洗1、2和3 min。样品溶液的