诊断超声与超声治疗仪联合载阿霉素超声纳米泡作用于鼻咽癌细胞的体外实验研究.docxVIP

? ? 诊断超声与超声治疗仪联合载阿霉素超声纳米泡作用于鼻咽癌细胞的体外实验研究* ? ? 陆柳桂，黄钊希，韦丽艳，高 泳 (广西医科大学第一附属医院超声科，南宁 530021) 鼻咽癌为中国南部和东南亚地区好发的恶性肿瘤，中、晚期鼻咽癌的治疗以放疗或同步放化疗为主[1]。阿霉素（doxorubicin，Dox）是一种广谱周期非特异性抗肿瘤药物，但其严重的心肾毒副作用，大大限制其在临床上的应用[2]。国内外较多研究表明，载阿霉素超声纳米微泡（Dox-NBs）联合超声辐照目标组织可有效促进Dox-NBs 向血管外肿瘤组织渗透，并释放纳米微泡所包封的药物，增加药物靶向利用率和细胞毒性，提高肿瘤化疗疗效[3-5]。近年来，利用超声治疗仪（therapeutic ultrasound，TUS）或诊断超声（diagnostic ultrasound，DUS）联合载药或基因纳米微泡在辐照部位产生空化效应，使肿瘤血管内皮细胞间隙增大，提高药物或基因从血管渗入肿瘤组织的治疗方法已有较多的研究[6-10]，但对比DUS 与TUS 分别联合载药超声纳米泡对肿瘤化疗效果的评价，目前国内、外鲜见报道。因此，本研究通过制备Dox-NBs并检测其基本物理特性，研究其分别联合DUS 与TUS 体外药物释放情况及对鼻咽癌肿瘤细胞活性的影响，旨在为后续体内选择DUS或TUS辐照辅助肿瘤化疗提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 主要试剂 1，2-二棕榈酰-锡-甘油基-3-磷酸胆碱（DPPC）、MPEG-2000-DSPE（北京谨明生物科技有限公司）；1，2-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-和磷酸乙氨醇（DPPE）、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸（DPPA）、甘油、盐酸Dox、N，N-双（丙稀酰）胱胺（BAC）、Irgacure2959（上海麦克林生化科技有限公司）；氯仿（成都科隆化学品有限公司）；全氟丙烷气体（C3F8,深圳金谷气体有限公司）；Pluronic124（美国Sigma-Aldrich）；N，N′-二乙基丙酰胺（NNDEA，上海贤鼎生物科技有限公司）；甲醇（四川西陇科学有限公司）；1×PBS缓冲液 无菌（pH=7.0～7.2，Biosharp）；细胞计数试剂盒（CCK-8）（批号Biosharp）。 1.1.2 主要仪器 XS205DU十万分之一天平（梅特勒-托利多）；KQ-501DB超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；XD-W2308 加热板（深圳市兴达恒业科技有限公司）；HH-420恒温水浴锅（金坛市易晨仪器有限公司）；HL-AH（G8）银汞调和器（杭州中润医疗器械有限公司）；Zetasizer NanoZS 纳米粒度电位仪（英国马尔文仪器有限公司）；EVOS FL Auto显微镜（美国Life Technologies公司）；血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司）；UT1021 超声治疗仪（深圳东迪欣科技有限公司）；诊断超声（美国GE LOGIQ E9）；冷冻干燥机（德国ALPHA 1-2 LD plus）；Synergy H1 多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；85-2恒温磁力加热搅拌器（常州翔天实验仪器厂）。 1.2 实验方法 1.2.1 Dox-NBs 的制备（1）称取一定比例的DPPC、DPPA、DPPE和MPEG-2000-DSPE，与氯仿形成混合液，在37 ℃超声波清洗仪振荡充分溶解；（2）将溶液分装至西林瓶，放置在加热板挥发呈薄膜状；（3）加入一定比例的Pluronic 124、Dox、Irgacure 2959 溶液及甘油，65 ℃水浴锅中30 min 混合均匀；（4）注入C3F8 气体；（5）银汞调和器高速振荡60 s，254 nm 紫外灯下照射30 min，4 ℃倒置分层1 h，取下清液即为Dox-NBs。 1.2.2 Dox-NBs 表征检测 荧光显微镜观察纳米泡载阿霉素情况。用PBS 缓冲液稀释Dox-NBs 1 000 倍后放入粒径、电位样品池中，利用纳米粒度电位仪检测仪测定样本的粒径、电位及分散度，仪器设置条件如下：T=25°C，激光波长=660 nm，角度=90°。普通光学显微镜观察Dox-NBs 形态分布情况，用PBS 缓冲液将Dox-NBs 稀释5 倍后，利用血球计数板计数Dox-NBs浓度。 1.2.3 Dox-NBs 中Dox 平均载药量及包封率的测定（1）使用分子截留量为12 000～14 000 u 透析袋将Dox-NBs 中游离的Dox 去除；（2）将透析好的样品在冷冻干燥机冻干；（3）称重冻干的载Dox 纳米颗粒，并将其以体积1∶1 的比例溶解在甲醇和PBS的混合溶液中；（4）在酶标仪波长λ=483 nm 条件下绘制Dox 浓度