基因工程药物课件.pptVIP

第1章 基因工程药物;重点：制备基因工程药物的根本过程;;;;;基因工程技术;基因组DNA文库;基因工程技术;cDNA文库的组建：;3、PCR技术 PCR技术：1985年由美国 Cetus 首创，可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便能够，比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。 获1993年诺贝尔化学奖。; PCR的原理：用于扩增位于两段序列之间的DNA片段，类似于天然DNA的复制过程。以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保存复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。; 变性 ：加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链。 退火 (复性) :降温后模板DNA与引物按碱基配对原那么互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″; 3. 延伸 ：将反响温度调节到酶的最适温度，在DNA聚合酶、4种 dNTPs 等存在的条件下，以引物的 3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～40个循环后DNA可扩增106 ～ 109 倍。; PCR 的基本反应步骤;双链DNA分子;双链断开;模板与引物结合;循环1;循环1;循环1;双链断开;模板与引物结合;循环2;94℃变性 双链断开;循环3;循环3;循环n;基因工程技术;基因工程技术;*/35;*/35;*/35;*/35;基因工程技术;*/35;*/35;*/35;*/35;核糖核酸〔RNA〕酶： RNaseA：RNA专一的内切酶，可特异的作用于嘧啶核苷酸，主要用于除去DNA制备物中的RNA。 RNaseH：是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，但该酶不能消化单链或双链DNA，也不会降解单链RNA。;DNA连接酶：既可以连接两个具有粘性末端的DNA片段，也可以连接两个具有平末端的DNA片段 DNA聚合酶：是细胞复制DNA的重要作用酶。DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5端点开始复制到3端的酶。;脱氧核糖核酸酶：是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5-P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。在Mg2+存在时，能在双链DNA上随机地产生切口；而在Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片段化。;*;*;*;*;*;*;*;*;DNA重组;重组DNA导入受体菌 　1.转化：细菌获得外源质粒DNA，产生新的遗传性状的过程。自然状态下外源DNA进入细胞的效率很低。一般采用热激法〔感受态细胞〕和电穿孔法 　2.感染〔转导〕：以噬菌体为媒介，将外源DNA导入细菌的过程。 　3.转染 指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组DNA分子的过程。 　转导和转染的区别 　　　转导：通过λ噬菌体〔病毒〕颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA转移到受体细胞的过程。 　　　转染：λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞的过程。;平板培养基培养细菌;重组菌的筛选 1、根据重组菌的标志直接筛选〔抗性〕 2、核酸杂交法〔核酸探针〕 3、PCR法 4、DNA限制内切酶法 5、核苷酸序列测定法;基因工程菌表达水平的优化 高效基因工程菌：具有高的产物表达水平、稳定的遗传特性和较强的目标产物积累能力。 1、启动子的优化；2、密码子优化；3、表达系统优化〔菌株选择〕等;作业;微生物培养技术;高产菌株的选育与基因工程菌的构建 菌种选育常用的方法是自然选育和诱变选育 基因工程菌的构建属于定向选育 第一个获得商业化的基因工程菌时转入胰岛素基因的大肠杆菌 血红蛋白也得到了应用;分批培养中细菌的群体生长(131xing);1、分批式操作;*;*; 延迟期：延滞期、停滞期等 特点 合成代谢活泼，易产生诱导酶； 细胞形态变大或增长，生长速率是零； 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强； 对外界不良条件敏感。;影响延迟期长短的因素： 菌种：繁殖速度快，延迟期较短； 接种量：一般来说，适当增大接种量可缩短甚至消除延迟期〔发酵工业上一般采用1/10的接种量〕； 培养基成分：①在天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上的短；②接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长。 在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期;对数期：细胞数目以几何级数增加，