应激对即早基因表达的调节作用及其与crfmrna、hpa通路和行为的关系.docxVIP

应激对即早基因表达的调节作用及其与crfmrna、hpa通路和行为的关系 心理反应是指个体“意识到”环境对生理心理和社会功能系统的负荷，其反应可能是适应的或较差的。最近发现一对关系密切的原癌基因(proto-oncogens)c-fos/c-jun在中枢神经网路上,可由于心理应激等活动而立即、及时地进行转录,一过性地表达转译为Fos/Jun核蛋白,然后返回核内参与组成对其它靶基因转录调节的“转录因子”(transcriptive factors)。这类原癌基因被称为“即刻早期基因”(IEG,immediate early genes)。但目前对即刻早期基因究竟在心理应激中扮演什么角色以及其与经典的应激通路下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的关系尚不清楚。 本研究通过制造社会失败(social defeat)应激动物模型,以研究应激对即刻早期基因c-fos表达的调节作用及其与CRFmRNA,HPA通路和行为之间的关系。 材料和方法 一、 社会失败溶液内温度 1.模型:雄性Sprague-Dawley大鼠(中国科学院上海实验动物中心),体重200-300g,社会应激模型基本按照Miscek的方法,雄性大鼠长期单独饲养。实验开始时,将实验组大鼠放入单独饲养大鼠笼中,单独饲养鼠会攻击实验鼠,撒咬侵入者的颈部与背部。在第一次攻击发生后实验持续8分钟,允许10分钟作为攻击潜伏期。社会失败(social defeat)的定义是:实验大鼠至少受到一次攻击,并且表现出驯服的姿势,如防御性直立,仰卧,静止不动等。 2.行为测验:a.反映焦虑情绪的高架十字迷宫(plus maze):高架十字迷宫包括两条开放臂(50×10cm)和两条闭合臂(50×10×40cm),由中央区(10×10cm)联结,室内为暗光(80lux)。实验过程伴白噪声。单盲,二位观察者分别观察每组50%的动物。大鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫,记录5分钟内活动的情况,观察指标:(1)闭合臂进入次数(必须有两只前爪进入臂内);(2)开放臂进入次数;(3)闭合臂停留时间;(4)开放臂停留时间。b.反映探究活动及情绪反应的空场实验(open field method):木制箱100×100×50cm,地板用笔划成25方格20×20cm,沿墙格称外周格,其余为中央格。将动物放在正中央格,观察12分钟内活动情况。观察指标(1)方格间穿行次数:三爪以上跨入邻格的次数;(2)竖起或修饰次数:两前肢离地1cm以上的次数;(3)中央格停留时间。 二、 免疫组化和血清fli着色法 (一)免疫组化:主要试剂:Ⅰ抗:兔多克隆fos抗体(由美国Santa Cruz Biotech生产),fos抗体的特异性已被检验过,用过量的纯化fos蛋白与此抗体混匀后,用混合液做免疫染色,在阳性组织切片上结果为阴性。Ⅱ抗、Ⅲ抗:Dako公司ABC试剂盒。DAB(Sigma)。 (二)方法:A灌注与取材:各组动物分别于应激后1小时,腹腔内注射戊巴比妥钠(60mg/kg)深度麻醉后,打开胸腔,经心主动脉插入导管,先用0.9%生理盐水灌洗(压力为100-120mmHg),再用新鲜配制的4%多聚甲醛(0.1M,PH值7.4)300ml,以先快后慢的原则灌注固定20分钟,取材后浸入30%蔗糖PBS(PH7.2)至脑组织下沉,AO切片机30μm连续冠状切片。B免疫组化反应步骤:脑片在PB中漂洗3次,然后在1.5%正常封闭血清中孵育20分钟抑制非特异性IgG,PB漂洗5×5min,含兔抗fos多克隆抗体(15000)4℃过夜,PB漂洗5×5min,生物素化二抗在1100的PB中室温下反应1hr,PB漂洗5×5min,ABC液1 10室温反应1hr,PB漂洗2×10min,用0.5%的TritonX-100/PBS洗30秒,在0.05%DAB,0.01%H2O2的TB中反应约10min显色,显微镜下控制,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。 C对照实验:用NGS和PB分别取代一抗和二抗做免疫组化,其余步骤同上。 (三)原位杂交 1.材料与试剂:DIG3′端标记试剂盒和DIG检测试剂盒均购自德国Boehringer Mannheim公司,CRFmRNA寡核苷酸探针由美国Cybersyn公司合成,序列为:5′-CAGTTTCCTGTTGCTGTGAG-CTTGCTGAGCTAACTGCTCTGCCCTGGA-3′,经过GenBank同源序列检索。 2.寡核苷酸3′端标记步骤以及原位杂交步骤参照德国Boehringer Mannheim公司方法。 (四)内分泌激素测定:1放射免疫分析方法(RIA)检测血浆ACTH:RIA试剂盒由DPC公司提供2.酶联免疫吸附方法(ELISA)检测血清Cortisol:Cortisol试剂盒(ELISA)由B