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蛋白纯化技术 徐剑光2023.7.9第1页 Contents层析概述四大层析纯化策略第2页 层析概述“色层分析”俄国植物学家M.Tswett于1923年首先提出原理：利用各组分在流动相和固定相之间物理性质（吸附、分派等）差异，对多组分混合物进行分离办法。常见：吸附层析，分派层析第3页 层析概述—参数与术语分离体积辨别率选择性柱效对称性线性流速载量第4页 层析概述—参数与术语VR=V0+kVi分离体积第5页 层析概述—参数与术语辨别率：辨别峰能力第6页 层析概述—参数与术语第7页 层析概述—参数与术语第8页 层析概述—参数与术语第9页 层析概述—参数与术语第10页 层析概述—塔板理论速率理论塔板理论：将色谱柱假想为一种精馏塔，色谱柱中固定相形象化为一系列连续、相等体积塔板。每一块塔板高度称理论塔板高度H（板高）。第11页 层析概述—塔板理论速率理论速率理论：吸取了塔板理论概念，并把影响塔板高度动力学原因结合进去，定量地解释了影响塔板高度多种原因。其中：A、B、C为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数和传质阻力系数 。上式即为范第姆特方程式简化式。第12页 层析概述—塔板理论速率理论A=2λdp气流遇到填充物颗粒时，不停变化方向，使试样组分在气相中形成紊乱类似涡流流动。第13页 层析概述—塔板理论速率理论色谱柱轴向分子扩散（轴向扩散）浓度梯度引发分子扩散行为（浓差扩散），造成峰展宽。B = 2?Dg?：弯曲因子，反应柱填充物对分子扩散妨碍程度Dg：试样组分分子在气/液相中扩散系数(cm2·s-1)第14页 层析概述—塔板理论速率理论传质阻力——传质过程（平衡）中所受妨碍气液界面气相液相载气第15页 四大层析凝胶过滤层析离子交换层析疏水层析亲和层析 第16页 四大层析—凝胶过滤层析凝胶过滤层析：根据分子大小来分离生物分子一种简单可靠层析技术。第17页 四大层析—凝胶过滤层析怎么做？懂得分子量大小和差异（相差一倍以上）选择合适填料选择合适层析柱第18页 四大层析—凝胶过滤层析主要应用：组分离 脱盐/缓冲液置换精细分离 聚集体清除，分离不一样分子大小蛋白检测用途 计算分子量 纯度检测 第19页 四大层析—凝胶过滤层析试验步骤：平衡-上样-洗脱-再生第20页 四大层析—离子交换层析离子交换层析： 根据不一样生物分子所带电荷性差异进行分离一种办法。正负电荷互相吸引第21页 四大层析—离子交换层析原理——蛋白质荷电滴定曲线第22页 四大层析—离子交换层析第23页 四大层析—离子交换层析怎么做？选择离子交换填料 阳离子/阴离子，强/弱选择缓冲液 PH，缓冲体系，添加剂选择洗脱方式 线性洗脱or步级洗脱第24页 四大层析—疏水作用层析疏水作用层析： 根据生物分子之间疏水性差异进行分离一种办法。第25页 四大层析—疏水作用层析疏水作用层析原理：第26页 四大层析—疏水作用层析疏水作用填料：第27页 四大层析—疏水作用层析怎么做？PH，温度，盐种类第28页 四大层析—亲和层析亲和层析： 通过生物分子间特异性互相作用来分离物质一种办法。第29页 四大层析—亲和层析亲和层析原理：第30页 四大层析—亲和层析亲和层析步骤：平衡上样洗脱重生第31页 纯化策略建立检测办法确立目标（纯度和产量）目标蛋白性质使用不一样原理纯化办法减少步骤尽可能减少每步之间样品条件变化选用高选择性办法工艺办法尽可能简单….开发纯化办法注意点：第32页 纯化策略三步法：捕捉中度纯化精纯第33页 纯化策略捕捉：速度，载量目：浓缩，稳定蛋白第34页 纯化策略中度纯化：辨别率，载量目标：清除主要杂质第35页 纯化策略精纯：辨别率，收率目：除去痕量杂质第36页 纯化策略适用于三步纯化策略层析技术：第37页 纯化策略衔接层析技术时注意事项：第38页 纯化策略设计合理纯化线路：ACcaptureIntermediatepurificationpolishingACACIEXHICHICIEXGFGFGFIEX第39页 Thanks for listening and sleeping第40页