蛋白质分离纯化.pptxVIP

蛋白质分离纯化;蛋白质分离纯化;样品前处理;蛋白质分离办法;根据蛋白质溶解度差异分离 —沉淀技术 可逆沉淀： 等电点沉淀、盐析法、有机溶剂沉淀 不可逆沉淀： 热变性沉淀、重金属盐沉淀、有机酸沉淀;1、根据溶解度不一样;（2）等电点沉淀法1）pH 偏离pI时，蛋白质带相同符号净电荷而互相排斥→蛋白质溶解度大。2）pH = pI时，蛋白质净电荷为0→蛋白质聚集沉淀3）等电点沉淀法缺陷：沉淀不完全。 ;2、根据分子大小不一样;透析——只用于除盐类和小分子杂质;透析——只用于除盐类和小分子杂质;2）超滤（ultrafiltration）：是利用压力和离心力，借助于超滤膜将不一样分子量物质分离技术。Ultrafiltration功能：纯化和浓缩（同PEG，聚乙二醇）。Ultrafiltration膜：丙烯氰、醋酸纤维素、硝酸纤维素和尼龙等。;超出滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质;（2）凝胶层析;原理： 1、分子量大物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱液从凝胶粒子之间空隙挤落下来，因此大分子物质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部，因此小分子物质迁移速度慢。;;;;;（3）密度梯度离心;密度梯度离心;3、根据带电性质不一样;（1）电泳法;垂直板电泳;垂直板电泳;垂直板电泳;聚丙烯酰胺凝胶电泳;连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统：缓冲液离子成份，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不但有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清楚度及辨别率均较前者佳;;浓缩效应： ;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;;SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;;等电聚焦（ Isoelectric focusing）;（2）离子交换层析;离子交换剂能够分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一种带电可进行离子交换基团。平衡离子是结合于电荷基团上相反离子，它能与溶液中其他离子基团发生可逆交换反应。 平衡离子带正电离子交换剂能与带正电离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电离子交换剂与带负电离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。 当蛋白质处于不一样pH条件下，其带电情况也不一样。;离子交换层析;;;离子交换层析;4、根据配体特异性不一样;亲和层析基本原理：生物分子间存在很多特异性互相作用，如我们熟悉抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆结合，这种结协力就称为亲和力。亲和层析分离原理简单说就是通过将具有亲和力两个分子中一种固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力特异性和可逆性，对另一种分子进行分离纯化。;被固定在基质上分子称为配体，配体和基质是共价结合，组成亲和层析固定相，称为亲和吸附剂。 亲和层析时首先选择与待分离生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶能够选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体能够选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在合适不溶性基质上，如常用Sepharose－4B 等。 将制备亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱时候，待分离生物分子就与配体发生特异性结合，从而留在固定相上；而其他杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离生物分子。通过合适洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化待分离物质。;;;小 结;蛋白质分子中氨基酸序列确定;蛋白质分子量测定;蛋白质分子量测定;蛋白质分子量测定;蛋白质分子量测定;蛋白质分子量测定;氨基酸平均分子量为128，测得某蛋白质分子量约为5646.由此推断该蛋白质具有肽链条数和氨基酸个数依次是？ ;测定步骤 1 多肽链拆分。由多条多肽链组成蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 2 测定蛋白质分子中多肽链数目。通过测定末端氨基酸残基摩尔数与蛋白质分子量之间关系，即可确定多肽链数目。 3 二硫键断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成巯基，以避免它重新被氧化。 ;4 测定每条多肽链氨基酸组成，并计算出氨基酸成份分子比或多种残基数目 用6mo