蛋白质研究方法.pptxVIP

蛋白质研究办法 ;第一节 蛋白质提取;目蛋白研究基本流程 ;一、蛋白质样品提取;;1. 细胞破碎;2. 去污剂处理溶解膜蛋白;3. 蛋白质分子稳定; 细胞内有许多种还原成份，一旦细胞破碎 由于和氧接触以及稀释作用而使抗氧化 成份减少，造成许多蛋白质被氧化而失去活 性，如巯基蛋白 ; 蛋白质环境原因 ;4. 离心清除细胞碎片;层析基本理论;第13页;第14页; 假设有两种互不混溶溶剂S和M，将A物质溶于一 定量S溶剂中，再加入一定量M溶剂 A物质在两相中互相扩散 A物质在两相中达成了平衡(在同一时间内，进出两 相A物质分子数完全相等)时，其分派系数为常数 ;二、分派层析机理;（3）在分派层析柱中，溶质在两相中达成分派平衡速度很快，并且A物质存在不影响B物质分派性质，反之亦然 （4）在该溶剂系统中，A和B两物质分派系数分别设为：; 假如在层析开始时，在第一层S相中同步加入A和B两种物质，加入量均为1。根据分派定律，M加入后，在两相中立即进行分派，并且很快达成分派平衡。第一次分派前后A和B物质在S和M相中量为：;第19页;第20页;A和B物质在层析柱中 1. 分派10次；2. 分派20次；3.分派30次;二者之间总是存在着一定偏差，这是由于： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不也许在绝对分派平衡情况下进行 ; Martin和Synge计算了硅胶柱理论塔板数， 求得一种理论塔板高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米层析柱上最少能够进行1000 次分派。 ;塔板理论重点： 分派层析柱象分馏柱同样能够提成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定 条件下，一根分派层析柱理论塔板数是一定 在分派层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，并且在两相间达成分派平衡速度很快 体系中其他物质存在不影响待分离物质分派。 待分离物质存在也不影响其他物质分派 在分派层析柱上，物质在各个理论塔板中含量可 通过计算求得;第25页;6. 蛋白质检测和判定; 第二节 蛋白质定性定量分析; 蛋白质定性分析 (qualitative analysis);一、蛋白质含量测定; 蛋白质元素组成特点;1. 紫外光谱 (A280)吸取法;原 理;优 点;计算办法;2. 考马斯亮蓝G-250检测法;原 理;所需时间;计算办法;3. Lowry检测法;原 理;优 点;计算办法;4. BCA (二喹啉甲酸)检测法;原 理 ;优 点;第三节 蛋白质相对分子量测定;一、SDS测定蛋白质相对分子量;3. SDS基本原理; SDS作用：与蛋白牢靠结合，当其浓度大于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质结合百分比为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中多种蛋白质与SDS形成SDS-蛋白质复合物都带有相同密度负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然电荷差异; SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形长椭圆棒状复合物)，并且具有相同荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系 ; 在不连续电泳系统中，具有三种离子，两种不一样孔径凝胶，两种或两种以上不一样pH缓冲溶液 所谓不连续就是指凝胶浓度不一样样，缓冲液离子成份及pH不一样样 ; 凝胶层不连续性： 浓缩胶 (stacking gel) 分离胶 (separating gel);pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液; pH不连续性： 在浓缩胶与分离胶之间有pH不连续性，是为了 控制慢离子解离度，从而控制其有效迁移率 浓缩胶pH：6.7 分离胶pH：8.9 缓冲液pH：8.3 ;5. SDS测定分子量操作;;6. 注意事项; 第四节 测定蛋白质等电点;等电点 (isoelectric point, pI);;ReadyStripTM IPG Strips;第五节 蛋白质免疫印迹分析; 印迹技术 (blotting)是指将存在于凝胶中生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检