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基于物种多样性的厌氧反应器内颗粒污泥微生物种群结构研究 产甲烷污泥是高效厌氧反应体系稳定运行的基础和关键。现在，许多科学家已经研究了它们的形成机制、微观结构和微生物群。然而，在之前的研究中，很难使用电镜观察、培养基培养和计数等传统方法。这些方法可以由于自身的固有局限性而难以精确、深入地研究。生物技术可以克服传统方法的缺点，近年来广泛应用于微生物群的研究。一些中国科学家还将这些技术用于研究好氧和厌氧微生物群的微生物群，并取得了一些成果。产甲烷污泥结构特殊，其中古细菌与真菌并存。用分子生物技术全面研究微生物群的报道相对较少。在本实验中，以厌氧产甲烷反应不同运营阶段的污泥为研究对象，使用原荧光原杂交技术（昆虫）研究样品中真菌和真菌的相对数量和空间分布，并比较不同样品中真菌和假菌的结构差异。通过对旧细菌dgge谱中条段的胶回收、系统发育分析，以及根据器官技术条件对研究结果进行了讨论和分析。 1 材料和方法 1.1 产甲烷颗粒污泥样品的取得 试验中产甲烷颗粒污泥样品取自本实验室内的一个小试厌氧反应器,反应器为有机玻璃制成,总体积15L.接种污泥为处理实际淀粉废水的EGSB内的颗粒污泥.试验进水为葡萄糖自配水,按COD∶N∶P约为400∶2.5～5∶1的比例投加尿素和磷酸二氢钾,反应器内pH值控制在6.8～7.2之间,温度在35℃左右. 在反应器启动与稳定运行的过程中,每隔一定时间从反应器底部取出泥样,共取得4个产甲烷颗粒污泥样品,其中样品A:启动后第1d取得,即接种污泥;样品B:运行25d后取得,反应器的COD负荷约为20 kg/(m3·d);样品C:运行75d后取得,反应器COD负荷为35 kg/(m3·d);样品D:反应器停止运行1个月后,重新启动运行45d后取得,COD负荷重新恢复至35 kg/(m3·d). 1.2 细菌保鲜和成像 采集污泥样品后,立即用4%多聚甲醛溶液固定,待PBS缓冲液洗涤后,于PBS缓冲液和100%乙醇两者的等体积混合液中在-20℃下保存,再利用石蜡包埋切片技术进行处理. 采用CY3(红色)标记的EUB338探针和FITC(绿色)标记的ARC915探针,其序列见表1.对上述预处理后的颗粒污泥样品进行双重原位杂交,杂交温度为46℃,杂交甲酰胺浓度分别为25%和35%.同时利用DAPI(4P,6-diamidin-2-phenylindole)染色作为泥样中所有微生物的背景,在Olympus激光共聚焦显微镜上扫描成像观察. 1.3 总dna提取 采用滚珠振荡机械破碎法提取,将颗粒污泥放入磨砂滚珠离心管中,加CTAB充分振荡,再用fastprep振荡破碎仪(Bio-Rad公司)振荡1min;样品破碎后,采用溶菌酶蛋白酶K水解,Tris-饱和酚抽提与异丙醇沉淀分离提取DNA;最后采用DNA纯化试剂盒A014(鼎国公司)进行纯化. 1.4 pcr扩增dcke 使用PTC-200扩增仪(MJ公司)进行PCR扩增,扩增对象为16S-rDNA的V2-V3可变区.对于真细菌,引物为PRBA8F与PRUN518R;对于古细菌,引物为PARC109F与PRUN518R;其序列见表2,为提高DGGE分辨效率,在PRUN518R的5′端加GC卡. PCR反应体系中各物质最终浓度如下:10×PCR缓冲液10%,MgCl2溶液1.5mmol/L,dNTP 200μmol/L,引物各0.5μmol/L,模板5ng/μL,TaqDNA聚合酶0.025μ/μL.对于真细菌,按照94℃变性1min,60℃退火30s,72℃延伸1min循环25次;对于古细菌,除退火温度为55℃外,其它条件均与上述相同. 1.5 微生物种群相似度 在Dcode系统(Bio-Rad公司)上进行DGGE分析,聚丙烯酰胺凝胶浓度为8% ,真细菌和古细菌的变性剂浓度范围分别是35%～50% 和30%～50%,在1×TAE 缓冲液中,以120V电压,60℃恒温电泳5～6 h.电泳后,以1×SYBR Gold (Invitrogen公司)染色,用GSD 8000成像系统(UVP公司)进行结果观察和照相.以Phoretix1D软件(Nonlinar公司)对DGGE图谱进行分析,考察样品之间的微生物种群的相似性,并绘制相似性分析图. 1.6 序和系统发育分析 2 结果与讨论 2.1 产甲烷颗粒污泥的主要细菌分布 对前3个污泥样品进行FISH实验,结果如图1.在样品A、B、C中真细菌含量均明显高于古细菌;真细菌主要分布在颗粒污泥外层,古细菌主要分布在内层,而颗粒中心则基本未表现出生物活性;且随着反应器COD负荷的增加以及运行时间的延长,古细菌的数量相应略有增加,其分布更趋向于颗粒污泥的中心区域. 在产甲烷颗粒污泥中,水解菌、发酵产酸菌以及产氢产乙酸菌等真细菌并不是十分严格的厌氧细