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基于超高分辨率显微镜成像技术的纳米二次离子质谱技术 氮（n）、碳（c）、硫（s）等生命因素的生物地球化学循环过程主要由微生物驱动。耦合分析自然环境中微生物遗传多样性与其代谢多样性是当今微生物生态学研究的难点和热点。自然环境中的微生物多样性极为丰富,每吨土壤中的微生物类群可高达400万种,海洋中的微生物类群也超过200万种。实验室富集分离的传统纯培养方法对微生物生理生态功能的认识做出了巨大贡献,但截止到2003年7月,全球范围内仅分离培养出4800种细菌,这极大地限制了人们对微生物功能多样性的认识。过去几十年里,人们通过从环境样品中提取微生物DNA直接进行聚合酶链式反应(PCR),并利用PCR产物构建克隆文库并进行测序分析,发现了大量的未知序列。通过将这些未知序列与已知的分离培养微生物序列进行比对,从而推测这些未培养微生物的可能代谢类型,成为人们认识微生物多样性和功能的重要手段。但是,具有相似16S rRNA基因组成的类群不一定具有相同的代谢功能,丰度较高的微生物并不一定发挥更重要的生态功能,而且PCR反应可能带来一定的偏差,这成为基于PCR的分子生物学研究手段的主要缺陷。考虑到微生物的广泛分布及其在元素地球化学循环中的重要作用,需要更先进的技术对自然环境样品中的微生物群落和功能进行探测。 近年逐步兴起的纳米二次离子质谱技术(NanoSIMS)在国际上已被广泛应用于地球科学、材料科学、比较行星学、生物医学和矿物学等领域,并在微生物生态学研究中显示出巨大的潜力,是当前最为先进的表面和界面分析技术,具有广阔的应用前景。通过利用稳定性或放射性同位素在原位或者微宇宙条件下标记目标微生物,并与特异性的荧光原位杂交技术(FISH)、催化报告沉积荧光原位杂交技术(CARD-FISH)、卤素原位杂交技术(HISH)等联合应用,NanoSIMS为从单细胞成像水平上研究复杂环境样品中微生物群落的组成和代谢特征提供了前所未有的可能性,其极高的灵敏度和准确性比其它的单细胞研究手段更具优势。本文将对纳米二次离子质谱的工作原理及其在微生物生态学研究领域的相关应用、存在的问题和发展趋势等进行简要介绍。 1 次离子质谱成像技术 二次离子质谱技术(SIMS)是20世纪70年代发展起来的一种表面分析技术,它以一种离子(如Cs+或O-初级离子束)轰击固体表面,再将从表面溅射出来的次级离子引入磁场质量分析器, 不同离子根据质荷比不同在静电场区被分离开,经质谱检测器检测记录并成像,得出被分析样品表面的元素或化合物的组分。SIMS可以检测从氢到铀的所有元素、同位素和化合物,并以检测原离子轰击样品表面产生的特征(“指纹”)次级离子谱为基础的,因此既可提供样品表面元素的信息,也可提供化学组分的信息,具有较高的空间分辨率和质量分辨率。SIMS技术经历了几次更新,被广泛应用于材料学、生物医学、地质学和土壤学等领域。SIMS一般分为静态SIMS和动态SIMS两种。静态SIMS,例如飞行时间二次离子质谱(ToF-SIMS),根据测定激发的二次离子飞行到接收器所用的时间来判断离子种类,一般对样品表面的一个到两个原子层( 1 nm)进行分析,只能提供关于样品浅层表面的信息,在应用于生态学研究时很难找到合适的条件同时满足较高质量分辨率和空间分辨率(一般只能达到微米级)的要求;而动态SIMS如CAMECA IMS 1270- 180型、CAMECA IMS- 3f- 7f型、及最先进的CAMECA NanoSIMS 50L型,主要根据二次离子在磁场中的偏转半径不同来确定离子种类,可以获得样品表面几微米内元素同位素分布和组成的信息(空间分辨率达到亚微米级或者纳米级),成像水平比静态SIMS明显提高,在微生物生态学中的应用也日渐成熟。 法国CAMECA公司生产的NanoSIMS 50L型是当前最为先进的动态二次离子质谱,相比于传统的离子探针具有极高的灵敏度和空间分辨率,其中铯(Cs+)离子源的分辨率达到50 nm,氧(O-)离子源的分辨率达到150 nm,并且具有极高的质量分辨率,如能够有效区分13C-与12C1H-、12C15N-与13C14N-之间的细微质量差异,并且能够同时对7种离子进行成像分析和精确定量。CAMECA NanoSIMS 50L与传统的二次离子质谱仪的工作原理非常相似,都是通过用一次离子束轰击的方式激发样品表面产生二次离子,进而分析样品表面元素同位素组成和丰度。具体工作流程为:首先将离子源(Cs+或者O-)产生的一次离子在真空加速器中加速形成具有几千电子伏特(KeV)的离子束,当这些高能量的离子束聚焦并轰击固体薄片样品表面(微生物细胞)时,溅射出样品中的二次离子,这些具有不同荷质比的二次离子由于在磁场中偏转半径不同而到达多接收器的不同位置,然后通过接收器上的法拉第环或者电