乳清蛋白水解肽对更年期小鼠骨密度的影响.docxVIP

乳清蛋白水解肽对更年期小鼠骨密度的影响 食物中的生物活性物质是现代营养学和食品研究的热点和发展趋势。目前有关矿物质元素结合肽的研究主要集中在酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides,CPP)—含有成簇的磷酸丝氨酰基的肽类化合物。CPP在中性或弱碱性环境中能与Ca2+结合成可溶性络合物,从而有效地防止钙在小肠环境中形成磷酸钙沉淀,使钙保持离子状态,从而促进钙的被动吸收。体外实验显示CPP能保持钙在小肠中的溶解性,从而促进钙的被动吸收。体内实验中,当饲料中钙质量分数为0.35%时,CPP/Ca为0.35或5.0,可显著增加钙的表观吸收率和股骨钙含量。当饲料中钙质量分数为0.5%~0.8%时,CPP促进钙吸收和利用的效果并不明显。 乳清含丰富的乳清蛋白,是干酪生产过程中的副产品,其质量分别是干酪、干酪素质量的9倍和27倍。近年来,干酪成为全世界消费量唯一保持连续上升的乳制品。在发达国家消费者的饮食结构中,干酪有着广阔的消费市场。在我国,由于经济、技术和饮食风俗等原因,干酪生产处于起步阶段。但即便如此,每年有大量乳清作为污水排放,仅北京华冠乳品公司和东直门乳品厂每年排放的乳清就达2万吨左右,因此副产物乳清的合理利用引起广泛关注。本项目利用胰蛋白酶对乳清蛋白进行水解,产生多肽,研究多肽的钙结合活性,开发出促钙吸收肽,这不但避免大量乳清蛋白资源的浪费,又可以防止污染环境。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 小鼠男性 实验动物由南京医科大学提供,ICR小鼠(雄性),50只,体重20~22g;低钙饲料按如下低钙配方制作(表1),钙质量分数为0.064%。 1.1.2 仪器、仪器和仪器 原子吸收分光光度计(HG9620A型,沈阳华光精密仪器公司)、固体密度测量仪(METTLER TOLEDO AG204型,瑞士)、电子天平(AUY-220,0.0001g,岛津SHIMADZU)、烘箱。 1.1.3 ca2+和po33- 酪蛋白磷酸肽的体外检测方法为:(1)检测体系的配制:量取酶解后的反应水解液30 ml于250 ml烧杯中,加70 ml蒸馏水使体系最终体积为100 ml,准确称0.1248 g的Na H2PO4和0.0888 g的Ca Cl2置于该烧杯中(使二者的终浓度均为0.008 mol/L),搅拌至完全溶解立即开始检测。(2)检测原理Ca Cl2和Na H2PO4可分别提供Ca2+和PO43-,两者可结合生成Ca3(PO4)2沉淀,并释放出H+,再用Na OH溶液中和释放出的H+。滴定过程中Na OH溶液消耗越快则表明肽的持钙活性低,反之则高。(3)检测方法:先将检测体系的p H调至7.20,不断滴加0.1 mol/L Na OH,使反应液p H保持在7.20。从p H调为7.20时开始计时,同时开始连续记录0.1 mol/L Na OH的消耗量。以时间为横坐标,Na OH溶液的消耗量为纵坐标作图。 研究表明:酪蛋白磷酸肽的氮元素和磷元素的摩尔比越小,则纯度越高,其在体内外阻止磷酸钙沉淀的作用就越大。为能得到氨基氮含量较高和活性较强的矿物元素结合肽,本实验用胰蛋白酶将市售的乳清蛋白粉进行水解,以水解液中氨基氮含量及肽活性的综合评分作为优化指标(最佳条件为:水解p H为8.0,底物浓度7.0%,底物:酶70:1,水解时间为100 min,水解温度为45℃,此条件下产生的肽体外持钙活性最强),然后将水解液通过最大截留分子量为6000 U的超滤膜过滤,以去除未被水解的蛋白质及多余的酶,将水解液初步纯化,得到活性较高的促钙吸收肽的粗提液。将粗提液设为低剂量组(肽含量约0.868 mg/g),部分粗提液浓缩制成高剂量组(肽含量约为1.736 mg/g)。 1.2 方法 1.2.1 试验分组和日常给药 小鼠以普通饲料适应性饲养1 w后,禁食12 h,按体重随机分为A、B、C、D、E五组,分别为低钙饲料(表1)对照组、低钙饲料补钙组、正常饲料对照组、低钙饲料促钙吸收肽低剂量组和低钙饲料促钙吸收肽高剂量组,每组10只,自由进食饲料,饮用去离子水,经口灌胃给予碳酸钙和样品。灌胃容积每头0.6 ml。每日给予的钙量为4.5mg;低钙对照组的钙仅从饲料中获得,饲料中钙质量分数为0.064%。实验期为4 w,每周称体重1次。 1.2.2 小鼠骨髓中m钙的检测方法 (1)体重:禁食12 h后称体重。(2)股骨湿重、干重和长度:实验结束后处死小鼠,剥离出双侧股骨,剔除肌肉和筋膜后,称湿重;取左侧股骨于80℃烘箱中干燥至恒重,称骨干重、游标卡尺测长度。(3)股骨指数:双侧股骨重/体重计算股骨指数。(4)骨钙含量:原子吸收分光光度计工作参数为:波长422.7nm;光谱通带2 nm;灯电流4 m A。钙标准曲线:分别取钙标准溶液,配制成0、