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风箱果组织培养再生植株再生体系的建立 具有很好的观赏性、抗旱性和不育性，也是药用植物。然而，目前自然栖息地的分布范围很小，种群数量低，已处于危险状态。需要加强保护和扩大范围。笔者在前期研究中发现,试管内生根效果虽然较好,但移植效果不理想;而试管外生根,生根和驯化同时进行,成本低,用时少。为此,笔者进行了风箱果组织培养不定芽的试管外生根及植株再生试验,旨在为建立风箱果商业化微繁和苗木培育体系、保护和扩繁珍稀植物提供一定的参考依据。 1 壮苗期培养成分 风箱果种子采自东北林业大学帽儿山实验林场的自然居群,进行播种育苗,待幼苗3个月时切取幼嫩顶芽作为初始外植体。外植体先用自来水冲洗30 min,在超净工作台上用75%酒精处理10～20 s,滴2滴Tween-20后,用H2O2处理3min,然后用无菌水冲洗3-5遍,按无菌操作要求,接种于培养基上。选取生理状态较好的顶芽,剥除顶芽最外层叶片,接种于诱导培养基上;然后切下通过诱导培养产生的腋芽,接种于增殖培养基上,诱导丛生芽;通过增殖产生的芽较小、细弱,节间太短,达不到生根的要求,因此,必须使增殖芽伸长和增壮,故将诱导产生的丛生芽接种于壮苗培养基上。基本培养基为MS培养基,附加25 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂,pH值为5.8。培养温度(25±2)℃,光照强度为30～40μmol·m-2·s-1,光照时间为16 h·d-1,湿度60%～70%。每瓶接入1个外植体,各处理重复5次。待试管苗长到2 cm以上时进行生根培养。 试管内生根培养基(单位为mg,L-1):(1) 1/2MS+IBAO.1;(2) 1/2MS+NAA0.1+IBA0.5;(3) 1/2MS+NAA0.1+IBA1.0;(4) 1/2MS+NAA0.5+IBA0.5;(5) 1/2MS+NAA0.5+IBA1.0;(6) MS+IBA0.1;(7) MS+IBA0.1;(8) MS+IBA0.5;(9) WPM+IBA0.1;(10) WPM+IBA1.0。 组培苗试管外生根:经过增壮培养后,选择生长健壮、高度在2 cm以上的不定芽进行试管外生根。首先将培养瓶的瓶盖打开,与外界空气接触锻炼。在培养室锻炼7 d后,移出不定芽进行生根。 不同质量浓度的NAA对生根的影响:用清水及50、100、200 mg.L-1的NAA溶液处理组培苗基部30 min;1 000 mg·L-1NAA处理苗基部10 s。 不同浸泡时间对生根的影响:选用100 mg·L-1NAA分别浸基部15、30、60 min,然后扦插于草炭和蛭石(V草炭:V蛭石=2:1)的混合基质中。 不定芽基部用上述不同质量浓度的NAA处理不同时间后,插入塑料育苗筐中的生根基质中。开始时育苗筐要密封,以保持高湿度环境,以后随时检查,并逐步将育苗筐盖打开,以便边生根边锻炼驯化,必要时可以适当遮荫。1个月后观察统计生根成活情况。 2 结果与分析 2.1 完善的前芽体培养基的诱导率 接种10 d后,顶芽萌动抽叶,20 d后在叶腋处长出新芽。从表1可以看出,不含激素的培养基(1号)没有产生增殖腋芽,试验中只是观察到高生长,长势也较弱,而添加激素BA和NAA的培养基,外植体大部分发生增殖,长势也较好。含有BA1.0～3.0 mg.L-1和NAA0.1～1.0 g·L-1的培养基均可诱导腋芽增殖,但在诱导频率和产生芽的数量上差异明显。其中以BA1.0mg.L-1和NAA1.0 g·L-1处理的诱导效果最好,诱导率达80%,繁殖系数为14.3个。在研究中发现,再生的不定芽玻璃化较重,尤其在BA水平较高时表现更为突出。BA在0.5 g·L-1水平上,NAA只有1.0 g·L-1时发生增殖;BA在1.0 g.L-1水平上,不同质量浓度NAA均发生增殖,并且随NAA质量浓度的增加,繁殖系数也增加,在1.0g·L-1时最高;BA在3.0 g.L-1水平上,随NAA质量浓度的增加,繁殖系数反而下降,而且玻璃化相当严重。 2.2 风箱果的增殖活性 4周后将7号培养基诱导产生的腋芽接种于增殖培养基上,30 d后观察增殖情况,结果见表2。 在增殖培养中,大部分组合产生腋芽增殖,且不定芽个数少,仅有BA0.8g·L-1和NAA0.4g·L-1、BA1.2g·L-1和NAA0.6g·L-1发生大量丛芽(见表2)。新芽转接到增殖培养基20 d后,在基部产生大量芽点,4周后在基部产生大量丛生芽。从表2可以看出,BA0.8 g·L-1和NAA0.4 g·L-1为风箱果离体茎端增殖适宜的外源生长调节剂质量浓度,再生频率为100%,每个外植体上产生18个以上的不定芽,产生的不定芽发育较整齐一致。观察发现,不定芽发生部位主要在外植体基部的切口处。 2.3 加标回芽的伸长 通过增殖培养产生的不定芽小、节间短、纤